Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

Abstract

תאי T מסייעים זקיקים (TFH) נתפסים כשושלת תאי CD4+ T עצמאית המסייעת לתאי B קוגניטיביים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ובכך לבסס חסינות הומורלית ארוכת טווח. במהלך זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל של תאי TFH ספציפיים לווירוס נקבעת בשלב ההדבקה המוקדם, וחקירות של תאי TFH ממוינים מוקדם הן חיוניות להבנת חסינות הומורלית תלוית תאי T ואופטימיזציה של תכנון החיסון. במחקר, תוך שימוש במודל עכברי של זיהום בנגיף הלימפוציטיס החריף (LCMV) ועכבר TCR-transgenic SMARTA (SM) עם תאי CD4+ T המזהים באופן ספציפי אפיטופ גליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, תיארנו נהלים לגישה למחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס בהתבסס על כתמי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, על ידי ניצול התמרה רטרו-ויראלית של תאי T מסוג SM CD4+ , ניתנות גם שיטות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם. לפיכך, שיטות אלה יסייעו במחקרים הבוחנים את המנגנונים העומדים בבסיס המחויבות המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

Introduction

במפגש עם פתוגנים או איומים שונים, תאי T נאיביים CD4+ מתאימים את התגובה החיסונית שלהם על ידי התמיינות לתת-קבוצות שונות של תאי T מסייעים (TH) עם פונקציות מיוחדות1. בתרחיש של זיהום ויראלי חריף, חלק גדול מתאי T נאיביים CD4+ מתמיינים לתאי T מסייעים פוליקולריים (TFH) המספקים עזרה לתאי B 2,3. בניגוד לתת-קבוצות אחרות של תאי CD4+ TH (למשל, תאי TH1, TH2, TH9 ותאי TH17), תאיT FH מבטאים רמה משמעותית של CXCR5, שהוא קולטן הכימוקין של תאי B המבייתים כימוקין CXCL13, מה שמאפשר לתאי

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזני העכברים הבאים: עכבר C57BL/6J (B6) (שני המינים), בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; CD45.1+SM TCR עכבר מהונדס (B6 CD45.1 × SM TCR מהונדס), שנ.......

Representative Results

מאפיינים של תאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם במהלך זיהום LCMV חריף
כדי לחקור את מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף, תאי SM CD4+ T קונגניים נאיביים המזהים באופן ספציפי אפיטופ LCMV GP I-AbGP66-77 הועברו באימוץ למושתלי CD45.2+ C57BL/6. למחרת, המושתלי?.......

Discussion

המחקר בתחום תאי TFH הודגש מאז גילוי הפונקציה המיוחדת של תאיT FH בסיוע לתאי B. מחקרים מצטברים הצביעו על כך שהתמיינות תאי TFH היא תהליך רב-שלבי ורב-גורמי30, שבו המחויבות לגורל תאי TFH נקבעת בשלב המוקדם5. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס ?.......

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32300785 ל- X.C.), התוכנית הלאומית לפוסט-דוקטורט בסין לכישרונות חדשניים (No. BX20230449 ל-X.C.), והפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה (מס' 2021YFC2300602 ל-L.Y).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

References

Explore More Articles

T TFHTFHLCMVSMARTATCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved