גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

Summary

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאי_{T FH} ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

Abstract

תאי T מסייעים זקיקים (T_FH) נתפסים כשושלת תאי CD4⁺ T עצמאית המסייעת לתאי B קוגניטיביים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ובכך לבסס חסינות הומורלית ארוכת טווח. במהלך זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל של תאי T_FH ספציפיים לווירוס נקבעת בשלב ההדבקה המוקדם, וחקירות של תאי T_FH ממוינים מוקדם הן חיוניות להבנת חסינות הומורלית תלוית תאי T ואופטימיזציה של תכנון החיסון. במחקר, תוך שימוש במודל עכברי של זיהום בנגיף הלימפוציטיס החריף (LCMV) ועכבר TCR-transgenic SMARTA (SM) עם תאי CD4⁺ T המזהים באופן ספציפי אפיטופ גליקופרוטאין LCMV I-A^bGP_66-77, תיארנו נהלים לגישה למחויבות הגורל המוקדמת של תאי T_FH ספציפיים לווירוס בהתבסס על כתמי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, על ידי ניצול התמרה רטרו-ויראלית של תאי T מסוג SM CD4⁺ , ניתנות גם שיטות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי T_FH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם. לפיכך, שיטות אלה יסייעו במחקרים הבוחנים את המנגנונים העומדים בבסיס המחויבות המוקדמת של תאי T_FH ספציפיים לנגיף.

Introduction

במפגש עם פתוגנים או איומים שונים, תאי T נאיביים CD4⁺ מתאימים את התגובה החיסונית שלהם על ידי התמיינות לתת-קבוצות שונות של תאי T מסייעים (T_H) עם פונקציות מיוחדות¹. בתרחיש של זיהום ויראלי חריף, חלק גדול מתאי T נאיביים CD4⁺ מתמיינים לתאי T מסייעים פוליקולריים (T_FH) המספקים עזרה לתאי B ^2,3. בניגוד לתת-קבוצות אחרות של תאי CD4⁺ T_H (למשל, תאי T_H1, T_H2, T_H9 ותאי T_H17), תאי_{T FH} מבטאים רמה משמעותית של CXCR5, שהוא קולטן הכימוקין של תאי B המבייתים כימוקין CXCL13, מה שמאפשר לתאי

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזני העכברים הבאים: עכבר C57BL/6J (B6) (שני המינים), בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; CD45.1⁺SM TCR עכבר מהונדס (B6 CD45.1 × SM TCR מהונדס), שנ.......

Discussion

המחקר בתחום תאי T_FH הודגש מאז גילוי הפונקציה המיוחדת של תאי_{T FH} בסיוע לתאי B. מחקרים מצטברים הצביעו על כך שהתמיינות תאי T_FH היא תהליך רב-שלבי ורב-גורמי³⁰, שבו המחויבות לגורל תאי T_FH נקבעת בשלב המוקדם⁵. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700