* These authors contributed equally
在这里,我们描述了一种在 3D 纤维蛋白水凝胶中生长的人 iPSC 衍生的胸腺类器官的形成方案,旨在支持胸腺上皮细胞 (TEC) 成熟和延长维持,以及体外胸腺生成。
功能性和自我耐受的 T 细胞库的产生是一个复杂的过程,主要取决于胸腺微环境,主要取决于其细胞外基质 (ECM) 的特性。胸腺上皮细胞 (TEC) 在胸腺生成中至关重要,通过过滤自反应性克隆来培育和选择发育中的 T 细胞。经验证明,TEC 对 ECM 提供的物理和化学线索特别敏感,经典的单层细胞培养会导致功能迅速丧失,直到它们死亡。由于这种精细的维护加上相对罕见性,尽管在体外模拟胸腺生物学的风险很高,但仍然缺乏能够大规模和随着时间的推移忠实地模拟 TEC 生态位的模型。在这里,我们描述了多细胞人胸腺类器官模型的形成,其中 TEC 区室来源于人诱导的多能干细胞 (iPSC),并与原代早期胸腺细胞祖细胞在三维 (3D) 基于纤维蛋白的水凝胶中重新聚集。该模型满足了当前对可扩展培养系统的需求,该系统可在体外复制胸腺微环境并展示功能,即在数周内产生 T 细胞和支持胸腺类器官生长的能力。因此,我们提出了一种通过 iPSC 衍生的类器官实现胸腺功能的实用体外模型,这将有利于 TEC 生物学和离体 T 细胞生成的研究。
胸腺是主要的淋巴器官,在产生有效且耐受的免疫系统中起着至关重要的作用 1,2,3。早期胸腺祖细胞 (ETP) 从骨髓迁移到胸腺,在那里它们扩增并分化为功能性 T 细胞 1,2,4,5。这些过程由一个特殊的群体,即胸腺上皮细胞 (TEC) 介导2,6,7。TEC 来源于胸腺上皮祖细胞 (TEP)8,9,由皮质 TEC (cTEC) 和髓质 TEC (mTEC) 组成,它们在创建 T 细胞迁移、扩增和成熟所需的专用 3D 微环境中发挥特定作用。TEC 主要通过提供生长和分化因子 1,10,11 以及通过自身抗原呈递负向选择无功能和不耐受的胸腺细胞来介导 T 细胞发育 5,7,12。发育中的 T 细胞和 TEC 之间的复杂相互作用在 TEC 细胞群的成熟和 3D 组织中也起着核心作用,这一过程称为胸腺串扰 1,11。胸腺细胞群之间的相互作用在很大程度上依赖于细胞外基质 (ECM) 形成的特定微环境。胸腺 ECM 与胸腺细胞群处于动态互惠状态,影响基因调控,并通过酶或基质蛋白的分泌不断重塑13。ECM 通过修饰生长因子和细胞因子的生物利用度、通过膜结合受体(如整合素)直接信号传导以及通过物理力塑造细胞骨架来影响细胞14。胸腺 ECM 成分(如胶原蛋白和层粘连蛋白)已被证明对生长因子 TGFb 和 FGF 具有高亲和力,这对 TEC 维持至关重要,并通过形成复合物来修复它们。胸腺 ECM 可塑性、弹性模量和密度在指导 TEC 命运和塑造胸腺的区室化方面也起着至关重要的作用,这对其功能至关重要。这些线索强调了考虑 ECM 及其 3D 结构以模拟体外胸腺的重要性。原代 TEC 在经典细胞培养设置中培养时会迅速去分化、失去功能并最终死亡这一事实支持了这一点 15,16,17。
已经开发了培养模型,以从人胸腺外植体中扩增功能性 TEC 群体,以保存 ECM 的结构及其为 TEC 提供的关键线索 18,19,20。该培养系统能够在体外成功扩增和维持功能性 TECs 群体,但无法维持超过 7 至 8 天的培养18。因此,开发一种能够在体外和长期复制胸腺微环境及其功能的可访问、实用的 3D 培养系统是该领域的关键赌注。最近,基于水凝胶的 3D 培养系统的开发导致了几种人工胸腺类器官系统的出现,构成了体外胸腺建模的重大进展 15,16,21,22。通过将人原代 ETP 与诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的人 TEP 重新聚集到球状体中,并将其接种在纤维蛋白水凝胶上,我们开发了一种人胸腺类器官 (hTO) 共培养系统。
本研究中材料和水凝胶设置的选择旨在复制胸腺 ECM 的天然结构,同时保持实用性和扩大工艺规模的能力,以获得负担得起且丰富的实验材料来源15。该 hTO 系统显示出多谱系分化潜力,可支持 ETP 的生产性胸腺生成23。该类器官系统构成了研究胸腺内细胞相互作用以及正常和病理人类淋巴细胞生成建模的可靠工具。iPS 细胞的使用还将基因编辑功能引入模型。在过去 15 年中,iPSC 有效分化为功能性胸腺组织一直是该领域的长期目标,并且在破译 TEC 谱系命运信号 21,24,25,26,27 方面取得了重大进展。为了满足对这种体外 3D 胸腺模型的需求,本技术说明描述了逐步生成 iPSC 衍生的人胸腺类器官的方法和技术细节,重点是水凝胶支架的形成、细胞微质量的再聚集和接种,以及类器官的培养和收获。
hiPSC 细胞系 hiN.Fm.m.Lon71.019 由雄性成纤维细胞产生,并通过 mRNA 转染重编程。hiPSC 细胞系 hiN.Fm.f.Lon80.002 由雌性成纤维细胞产生,并通过 mRNA 转染重编程。hiPSC 细胞系 hiN.Fs.f.MIPS203.003 由雌性成纤维细胞产生,并通过重组仙台病毒载体感染进行重编程。所有细胞系均由 Nantes iPSC 平台提供。患者知情同意将他们的细胞用于研究目的(匿名收集,Lonza,猫 # CC-2511)。根据宣言 DC-2017-2987 下的法国 CODECOH 法规,通过解离当天从南特医院 (CHU Nantes) 接受儿科心脏手术的患者那里获得的产后人类胸腺样本作为匿名丢弃废物来分离原发性 ETP。
1. iPSC 向 TEP 身份定向分化
注:自 Lai 和 Jin 发表的第一篇证明小鼠胚胎干细胞 (EScs) 向胸腺上皮身份分化28 的工作以来,一些研究已经开发并优化了描述人类 iPS 细胞定向分化为 TEP 身份的方案 21,24,25,26,27,29.这些研究导致表达胸腺上皮身份标志物(如 FOXN1 和 PAX9)的 TEP 24,25,28,30 以及功能标志物(如 DLL4 和 AIRE26)的分化,但缺乏 TEC 成熟标志物24,25.两种方法已被证明支持分化的 TEP 成熟为成熟的 TEC 身份:移植到体内模型(如小鼠)29 中,以及重新聚集到在气液界面设置中培养的 3D 胸腺类器官系统中21。这两个系统都证明了 3D 结构在维持和支持能够支持体内或体外 T 淋巴细胞生成蛋白的功能性 TEC 群体成熟方面发挥的关键作用 15,24,25,31。
2. 从儿科胸腺样本中分离原代 ETP
注意:ETP 是源自骨髓的祖细胞,产生 T 细胞谱系和胸腺内的树突状细胞,并表现出以下表型:CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33。
3. 3D胸腺类器官培养
该协议的工作流程总结于 图 4 中。对于这个 3D 类器官培养模型,我们采用了一种凝血酶和纤维蛋白原水凝胶,由于它提供的物理和机械信号,我们的团队以前曾使用这种水凝胶来维持原代小鼠 mTEC几天 34。聚合后,凝胶应呈现松散的海绵状网状结构(图 5)。
在初始接种和附着阶段之后,类器官在凝胶表面和最上层逐渐生长和发育。根据凝胶特性、接种条件和接种在凝胶上的类器官数量,类器官形成球形到长方形结构(图 6),偶尔合并形成更大的结构。培养第一周后,在类器官中观察到组织的两个特定亚水平:首先,我们观察到由大细胞从类器官照射并在各个方向定植水凝胶形成的长细胞表面投影状结构(图 6 和 图 7)。其次,我们观察到由集中在这些细胞投影周围的较小细胞形成的簇状结构。尽管我们无法分离出两种细胞类型来证实研究假设,但这种现象让人想起胸腺皮层中发现的 3D 排列,这是由单个 cTEC 与大量更小的发育 T 细胞相互作用形成的,称为胸腺护士细胞复合物11 (图 8)。
在类器官培养阶段的几个时间点,我们通过流式细胞术评估了胸腺类器官的细胞组成,并确定了几个关键区室:TEC(表征为 EPCAM+ CD45-)、胸腺细胞(EPCAM-CD45+CD3+)(图 9),以及包含胸腺造血非胸腺细胞亚群的 EPCAM-CD45+ CD3-隔室。更多细节可以在 Provin 等人 23 中找到。
图 1:iPSC 到 TEP 的分化表征。 (A) D13 处 iPSC 到 TEP 分化的示例,倒置相差显微镜,400 倍。比例尺:500 μm。(B) 点图示例,分化第 14 天 DAPI 细胞中 EPCAM + 细胞的比例,图像来自 FlowJo 10.0.7。(C) 在 iPSC 到 TEP 分化的第 16 天对 DAPI(蓝色)、PAX9(红色)和 KRT8(绿色)、免疫荧光和共聚焦成像进行免疫染色。白色箭头指向抗 PAX9 染色的示例。比例尺:50 μm (D) iPS 到 TEP 分化过程中 FOXN1 (RQ 到 GAPDH) 的表达水平。TEC:阳性对照参考,从儿科胸腺样本中分离的原代人 TEC。来自 Prism 的图形(GraphPad 版本 8.0.1)。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:水凝胶形成、类器官接种和培养基分布的实验装置。 (A) 将水凝胶浇铸到顶部和底部行的悬挂插件中的培养板。(B) 类器官接种:将含有 1 个类器官的切割移液管锥体放置在水凝胶上方,不接触水凝胶,将类器官轻轻接种在凝胶表面。(C) 通过将移液器的尖端定位在悬挂插件的臂之间,将培养基沉积在培养孔中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3:接种前胸腺类器官培养物的 D0(完整方案的第 13-15 天)。 (A) 用源自 Lon71.019 iPS 系的 TEC 产生的类器官。(B) 用源自 MIPS203.003 iPS 系的 TEC 产生的类器官。倒置相差显微镜,1000 倍。比例尺:500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 4:协议所有步骤的汇总表示。 收集儿科胸腺样本并解离,通过流式细胞术对原代 Lin- CD34 + CD7 + ETP 进行分类。iPS 细胞的分化是朝着 TEP 身份进行的。将 ETP 和 iPS 衍生的 TEP 合并并接种在低结合 96 孔板中,并在一夜之间聚集到胸腺类器官中。由抑肽酶、纤维蛋白原和凝血酶制备纤维蛋白水凝胶,并浇铸到悬挂插入物中。聚合后,将类器官接种在水凝胶上,并将 1 相培养基添加到孔中。类器官在培养物中保存长达 6 周。在 BioRender 中创建,AG26EFCZOM发布许可。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5:水凝胶的组织和结构。 倒置相差显微镜,1000 倍。比例尺:500 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:成熟的类器官和三维结构。 (A) 3D 培养第 24 天的胸腺类器官,MIPS203.003 iPS 线。(B) 3D 培养第 32 天胸腺类器官的合成图像,Lon71.019 iPS 线。倒置相差显微镜。比例尺:500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 7:胸腺类器官的结构细节。 (A) 3D 培养第 32 天的胸腺类器官,L71.019 iPS 线。(B) 3D 培养第 27 天的胸腺类器官,L80.002 iPS 线。倒置相差显微镜,400 倍。比例尺:500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 8:3D 培养第 32 天的胸腺类器官的结构细节。 白色箭头指向在 TEC 细胞附近增殖的小胸腺细胞簇。倒置相差显微镜,400 倍。比例尺:500 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图 9:胸腺类器官中 T 细胞区室的比例。 (A) 点图示例,3D 培养第 35 天胸腺类器官中活 (DAPI-) 细胞中 CD45+ CD3+ 细胞的比例,图像来自 FlowJo 10.0.7。CD45 + CD3 - 组分包括造血非胸腺细胞。(B) 在 3D 培养的第 17、24/25、32 和 39/40 天,胸腺类器官中活细胞中 CD45 + CD3 + 细胞的比例,n=2 在技术上一式两份或一式三份,来自 Prism 的图表(GraphPad 版本 8.0.1)。 请单击此处查看此图的较大版本。
单位 | 第 1 阶段培养基第 14 天至第 18 天 | 第 2 阶段 中等 第 19 天开始 | |
基础 | XVIVO10 | XVIVO10 | |
BMP4 | 纳克/毫升 | 50 | |
FGF8 | 纳克/毫升 | 10 | |
FGF10 | 纳克/毫升 | 10 | |
IGF1 | 纳克/毫升 | 10 | |
EGF | 纳克/毫升 | 10 | |
等级 L | 纳克/毫升 | 50 | 50 |
IL7 | 纳克/毫升 | 5 | 5 |
FLT3 L | 纳克/毫升 | 5 | 5 |
云函数 | 纳克/毫升 | 10 | 10 |
谷氨酰胺 | 纳克/毫升 | 1% | 1% |
表 1:补充剂及其各自的浓度。
抑肽酶 (μL) | 凝血酶 (μL) | 纤维蛋白原 (μL) | 1 相培养基 | 类器官 (单位) | |
24 孔板 | 5 | 75 | 75 | 1 | 3 到 5 |
12 孔板 | 9.2 | 138.2 | 138.2 | 1.8 | 5 |
6 孔板 | 16 | 240.8 | 240.8 | 3.2 | 8 至 9 |
表 2:在 6、12 和 24 孔板中制备水凝胶和接种类器官所需的组分比例。
与 2D 中的经典单层培养或更先进的最先进的 3D 模型(如 RTOC(聚集胸腺器官培养))相比,我们在这里描述的模型呈现出显着的改进。从技术角度来看,该模型提供了更高的可扩展性和可重复性,因为 TEC 来源于自我更新的 iPS 细胞。它还允许在 iPSC 阶段进行基因编辑,以便更轻松地在 TEC 中敲入或敲除研究。本研究中所示的胸腺类器官的存活率非常显著,与 2D 或 RTOC 培养相比,它提供了显着的改善,已证明 T 细胞生成长达 6 周(图 9)。因此,胸腺 3D 结构和 ECM 特性的重建导致我们的胸腺类器官中持续的胸腺功能,即从最成熟的胸腺细胞区室产生 T 细胞的能力,最近的胸腺移民在 3D 培养的第 4 周左右,产生 CD4 + 和 CD8 + T 细胞23。
由于胸腺微环境支持强烈的扩增和分化活动,因此适当的气体交换是任何体外胸腺模型中的关键参数。事实上,在维持在富集双氧气氛或气液界面的模型中观察到了改善的结果21,35。我们的观察结果支持这一点,并强调了在空气界面下方的水凝胶顶部正确接种类器官的重要性。聚合缺陷导致粘稠到液体水凝胶,将导致类器官在插入物底部下沉并阻碍其生长。与芯片内皮细胞共培养是一种很有前途的替代方案,可以通过增加血管形成来打破这一屏障。本研究中产生的胸腺类器官的大小仅限于 5 毫米左右,据称是由于核心区域缺乏气体和营养交换。因此,血管化将允许扩大培养规模,并结合工艺优化,允许生产包含数百万个 TEC 和 T 细胞的类器官。水凝胶的密度也是一个关键参数,鉴于酶对冻融循环的敏感性,其跨批次的可重复性是该方案的主要限制之一。水凝胶灌注步骤是方案中的关键步骤;我们建议在任何计划实验前 1 小时通过灌注一枚水凝胶进行测试,以检查试剂活性。如果酶活性不足导致聚合受损,并且考虑到 iPSC 衍生的 TEP 的成本,我们建议除了使用新鲜试剂等分试样重新开始实验步骤外,没有其他故障排除方法。TEC 是 ECM 的重要生产者;然而,鉴于最近对胸腺成纤维细胞作用的理解进展,将辐照成纤维细胞群添加到类器官模型中可能会很有趣。该群体可以分泌生长因子和 ECM,这些生长因子和 ECM 将参与复制胸腺环境,对 TEC 和 T 细胞分化和维持产生积极影响。这种胸腺类器官模型的另一个重要限制是缺乏适当的皮质-髓质分离。因为胸腺的荚膜成纤维细胞已被证明可以塑造皮层的形成,所以将它们添加到培养模型中可能有助于解决这一限制。因此,该协议引入了胸腺复杂体外模型的基础。它结合了 iPSC 胸腺分化、基于 3D 水凝胶的培养和体外淋巴细胞生成领域的最新进展。该模型可以进一步优化,以解决可扩展性并增加其复杂性,例如,通过添加间充质和血管隔室。因此,它可能会产生有价值的免疫研究平台或基于个性化 T 细胞的细胞疗法的应用。
我们要感谢由 Laurent David 领导的法国南特 iPSC 核心工厂的成员。这项工作得到了 JP-罕见病JTC2019计划 TARID 项目 (EJPRD19-208) 的支持,该项目由 ANR (ANR-19-RAR40011-5) 资助给 M.G.,由 la Région Pays de la Loire 资助给 M.G.,由 ANR (ANR-22-CE15-0045) 资助给 M.G. 和“SATT Ouest Valorisation”项目 OrgaTreg 到 M.G. N.P. 得到了“la fondation d'entreprise ProGreffe”的支持。M.d.A. 得到了“la Fondation pour la Recherche Médicale”的支持。我们感谢南特的 iPSC 核心设施,在 IBiSA 和 Biogenouest 的支持下,使用他们的资源和技术支持。这项工作部分由国家研究署通过投资未来计划 ANR-11-LABX-0016-01 支持的 Labex IGO 计划资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aprotinin | Sigma Aldrich | 616370 | |
BMP4 | Miltenyi | 130-111-165 | |
CCR7 (CD197) | BD Biosciences | PE | Clone: 3D12; Dilution: 1: 200 |
CD14 | BD Biosciences | FITC | Clone: M5E2; Dilution: 1: 200 |
CD19 | BD Biosciences | PE | Clone: HIB19; Dilution: 1: 200 |
CD205 | BioLegend | FITC | Clone: MG38; Dilution: 1: 200 |
CD3 | BD Biosciences | PE | Clone: HIT3a; Dilution: 1: 200 |
CD34 | BD Biosciences | FITC | Clone: 8G12; Dilution: 1: 100 |
CD4 | BD Biosciences | PE | Clone: RPA-T4; Dilution: 1: 100 |
CD4 | BD Biosciences | BV711 | Clone: L200; Dilution: 1: 200 |
CD45 | BD Biosciences | PerCP | Clone: HI30; Dilution: 1: 200 |
CD56 | BD Biosciences | PE | Clone: B159; Dilution: 1: 200 |
CD62L | BD Biosciences | BV605 | Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200 |
CD69 | BD Biosciences | BV510 | Clone: FN50; Dilution: 1: 200 |
CD7 | BD Biosciences | APC | Clone: M-T701; Dilution: 1: 200 |
CD8 | BD Biosciences | PeCy7 | Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200 |
CD8 | BD Biosciences | PE | Clone: HIT8a; Dilution: 1: 200 |
Dynabeads Pan Mouse IgG | Invitrogen | 11041 | |
EGF | Miltenyi | 130-097-751 | |
EPCAM (CD326) | BD Biosciences | PE | Clone: HEA-125; Dilution: 1: 200 |
EPCAM (CD326) | Miltenyi | BV711 | Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200 |
FGF10 | Miltenyi | 130-127-858 | |
FGF8 | Biotechne R&D | 423-F8 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | 341578 | |
FLT3 L | Peprotech | AF-300-19 | |
Glutamax | Gibco | 35050-61 | |
IGF1 | Miltenyi | 130-093-886 | |
IL7 | Peprotech | AF-200-07 | |
RANK L | Biotechne R&D | 6449-TEC | |
Red blood cell lysis solution | Miltenyi | 130-094-183 | |
RPMI1640 | Gibco | 11875093 | |
SCF | Peprotech | AF-300-07 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 605190 | |
TrypLE | Gibco | 2605010 | |
XVIVO10 | Lonza | LONBE04-380Q |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved