Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описывается использование клеток HepG2, индуцированных олеиновой кислотой, в качестве модели стеатотического заболевания печени, связанного с метаболической дисфункцией.

Аннотация

Распространенность стеатотической болезни печени, связанной с метаболической дисфункцией (MASLD), резко возросла из-за изменений в экономических моделях и образе жизни, что привело к серьезным проблемам со здоровьем. В предыдущих отчетах изучалось создание животных и клеточных моделей для MASLD, подчеркивая различия между ними. В этом исследовании клеточная модель была создана путем индуцирования накопления жира в MASLD. Клетки HepG2 стимулировали ненасыщенной жирной кислотой олеиновой кислотой в различных концентрациях (0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ) для эмуляции MASLD. Эффективность модели оценивали с помощью анализа набора для подсчета клеток-8, окрашивания Oil Red O и анализа содержания липидов. Это исследование было направлено на создание простой в эксплуатации клеточной модели для клеток MASLD. Результаты анализа набора для подсчета клеток-8 показали, что выживаемость клеток HepG2 зависела от концентрации олеиновой кислоты с ГИ50 1,875 мМ. Жизнеспособность клеток в группах 0,5 мМ и 1 мМ была достоверно ниже, чем в контрольной группе (P < 0,05). Кроме того, с помощью окрашивания Oil Red O и анализа содержания липидов изучалось отложение жира при различных концентрациях олеиновой кислоты (0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ) на клетках HepG2. Содержание липидов в группах 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ было достоверно выше, чем в контрольной группе (P < 0,05). Кроме того, уровни триглицеридов в группах ОА были значительно выше, чем в контрольной группе (P < 0,05).

Введение

Стеатозное заболевание печени, ассоциированное с метаболической дисфункцией (MASLD), включает в себя целый ряд состояний, включая простой стеатоз, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному 1,2,3,4,5,6, все они связаны с факторами, отличными от употребления алкоголя7. MASLD является наиболее распространенным заболеванием печени, вызванным метаболическим повреждением печени, поражающим почти четверть населения мира 8,9,10,11,12. Хотя точный патогенез MASLD до сих пор не выяснен, различные теории пытаются объяснить его развитие. Одно из преобладающих представлений предполагает отход от классической теории «двух попаданий» в сторону модели «множественных попаданий»1. Центральное место в этих гипотезах занимает роль инсулинорезистентности, которая, как полагают, имеет решающее значение в патогенезе MASLD13. Исследования показывают, что резистентность к инсулину в гепатоцитах приводит к повышению уровня свободных жирных кислот, впоследствии образуя триглицериды, хранящиеся в печени14,15.

Исследователи использовали модели как in vivo , так и in vitro для моделирования отложения жира в MASLD; Тем не менее, полное воспроизведение его патомеханизма остается сложной задачей. Несмотря на это ограничение, эти модели сыграли важную роль в изучении потенциальных терапевтических мишеней для MASLD. Тем не менее, разработка стабильной модели MASLD имеет решающее значение. Несмотря на то, что животные модели эффективны, они отнимают много времени и денег, что подчеркивает растущий интерес к клеточным моделям in vitro . В этих моделях часто используются одна или несколько свободных жирных кислот, таких как олеиновая кислота (ОА) и пальмитиновая кислота, для воссоздания MASLD, вызванной диетой. Среди них клеточная линия гепатобластомы человека HepG2 часто используется для создания in vitro клеточных моделей MASLD.

Индукция ОА стимулирует клетки HepG2 к репликации жирового отложения, аналогичного MASLD, методу с хорошо зарекомендовавшей себя историей. Цель данного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать жизнеспособность, окрашивание маслом Red O (ORO), содержание липидов и уровень триглицеридов (TG) в клетках HepG2, обработанных 0,25 мМ OA. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы предоставить дополнительные доказательства для развития исследований по моделированию МАЖБП.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в данном протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Культура клеток

  1. Культивирование клеток HepG2 в колбах для культивирования, содержащих модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 100 единиц/мл пенициллина и 100 μг/мл стрептомицина). Поддерживайте температуру колб с культуральными культурами при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 .

2. Влияние олеиновой кислоты на жизнеспособность клеток, измеренное с помощью набора для подсчета клеток-8

  1. Растворите определенный объем ОА в диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения концентрации 200 мМ. Храните раствор при температуре -20 °C для дальнейшего использования.
  2. Затравите клетки HepG2 в 96-луночный планшет при плотности клеток 6 × 10по 3 клетки в лунке. Добавьте по 100 мкл DMEM в каждую лунку. Инкубируйте и культивируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 24 часов. Разделите клетки HepG2 на две группы:
    1. Контрольная группа: добавить среду для культивирования клеток.
    2. Группа ОА: добавляют ОА в среду для культивирования клеток для достижения конечных концентраций 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ.
  3. Через 24 ч после первоначальной инкубации отбраковать надосадочную жидкость из каждой лунки и добавить ОА в соответствии с указанной группировкой, добавив 100 мкл на лунку. Для контрольной группы добавьте по 100 мкл среды для культивирования клеток в каждую лунку. Продолжайте инкубацию клеток еще 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в каждой группе есть шесть повторяющихся скважин. Чтобы предотвратить испарение, добавьте 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) во внешнее кольцо лунок в 96-луночной пластине.
  4. После 24 ч инкубации добавьте в каждую лунку по 10 мкл набора для подсчета клеток-8 (CCK-8), осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 2 ч в темноте. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора, поместите его в считыватель микропланшетов и измерьте значение поглощения на длине волны 450 нм (A450). Значения GI50 подсчитывались в соответствии с OD.

3. Окрашивание маслом Red O для наблюдения за внутриклеточным образованием липидных капель

  1. Семена клеток HepG2 в 6-луночные клеточные культуральные планшеты с плотностью 5 × 105 клеток в лунку и культивирование планшетов в инкубаторе с постоянной температурой в течение 24 ч. На рисунке 1 приведено визуальное представление описанных шагов.
  2. После 24 ч культивирования клеток добавьте 2 мл среды для культивирования клеток, содержащей ОА, в каждую лунку, достигая конечных концентраций 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ. Еще через 24 ч удалите среду для клеточных культур из каждой лунки и дважды промойте PBS. Добавьте по 1 мл фиксатора ORO в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут.
  3. Приготовьте раствор для окрашивания ORO, смешав раствор для окрашивания А с раствором для окрашивания В в соотношении 3:2. Дайте смеси постоять при комнатной температуре в течение 10 минут, затем отфильтруйте ее один раз через фильтр 0,45 мкм. Храните отфильтрованный раствор в центрифужной пробирке, защищенной от света до использования.
  4. Выбросьте фиксатор и дважды промойте дистиллированной водой. Добавьте по 1 мл 60% изопропанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 с. Выбросьте 60% раствора изопропанола и добавьте 1 мл свежеприготовленного раствора для окрашивания ORO в каждую лунку перед инкубацией в течение 20 минут. Выбросьте окрашивающий раствор ORO, добавьте в каждую лунку по 1 мл 60% изопропанола и выдержите 30 с. Смойте 5 раз водой, чтобы удалить излишки красителя.
  5. Накройте клетки дистиллированной водой и понаблюдайте под микроскопом. Как только изображения будут собраны, слейте жидкость с пластины и дайте ей высохнуть. Затем добавьте по 2 мл изопропанола в каждую лунку и встряхивайте пластину на орбитальном шейкере в течение 10 минут. Переложите жидкость в новую 96-луночную пластину, по 16 лунок в каждой группе, добавив по 100 мкл на лунку. Рассчитайте содержание липидов путем измерения оптической плотности (OD) каждой лунки с помощью считывателя микропланшетов с длиной волны 510 нм (A510).

4. Влияние различных концентраций олеиновой кислоты на общий триглицерид в надосадочной жидкости клеток HepG2

  1. Уравновесьте набор при комнатной температуре в течение 20 минут и подготовьте необходимые пластины для эксперимента.
  2. Соберите надосадочную жидкость для клеток и центрифугируйте в дозе 1570 × г в течение 10 мин. Установка стандартных скважин и испытание пробных скважин. Добавьте в стандартные лунки 50 μл стандартной концентрации ([S0 → S5] с последующей концентрацией: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 ммоль/л). В дополнение к пустой и стандартной лункам добавьте в лунки для проб по 10 мкл различных проб, после чего добавьте в каждую лунку по 40 мкл разбавителя пробы. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл детектирующего антитела-пероксидазы хрена, запечатайте пластинчатой мембраной и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч в духовке постоянной температуры.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, промокните насухо на непыльной бумаге и промойте каждую лунку 1x моющим раствором. Оставить настаиваться при комнатной температуре на 1 минуту. Повторите процесс стирки 5 раз.
  4. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл субстрата А и по 50 мкл субстрата В. Аккуратно перемешайте и выдерживайте в течение 15 минут при температуре 37 °C. Добавьте 50 мкл концевого раствора в каждую лунку и измерьте значение наружного диаметра каждой лунки на длине волны 450 нм (А450) в течение 15 минут.
  5. Построите график концентрации стандарта по оси x и соответствующего значения поглощения (OD) вдоль оси y, чтобы выполнить линейную регрессию и вывести уравнение кривой для расчета значения концентрации каждого образца.

5. Статистический анализ

  1. Определите существенные различия в количественных данных.
  2. Вычислите среднее значение ± стандартного отклонения (SD) и графически представьте данные. Считайте , что P < 0,05 является статистически значимым.

Результаты

Влияние олеиновой кислоты на жизнеспособность клеток
Клетки HepG2 подвергались воздействию различных концентраций ОА (0 мМ, 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ), что приводило к снижению выживаемости клеток при 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ по сравнению с 0 мМ. Статистическая значимость наблюдалас?...

Обсуждение

MASLD является клинико-патологическим синдромом, характеризующимся чрезмерным внутриклеточным отложением жира в гепатоцитах из-за факторов, выходящих за рамки алкоголя и других установленных агентов, повреждающих печень18. MASLD неразрывно связан с приобретенным метаболичес...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Настоящее исследование было предоставлено в рамках программы «Исследование по ключевым вопросам лечебного эффекта кумыса на региональные болезни монгольской медицины» в 2018 году при поддержке проекта программы «Наука и технологии» Департамента науки и технологий автономного района Внутренняя Монголия.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm filterMillex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 µm filterMillex
2 mL Crygenic VialsCORNING430659
25 cm2 Cell Culture FlaskCORNING430639
6-well cell culture plateCORNING3516
96-well cell culture plateCORNING3599
Blood Count PlateShanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.02270113
Cell Counting Kit-8 assaysBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. CA1210-1000T
CO2 incubatorNUAIRENU-5710E
 DMSO Dimethyl sulfoxide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
Enzyme Labeling EquipmentTecanSpark
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco10099141
HepG2 cells lineBeijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instructionNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Inverted Microscope for Cell CultureLeicaDMi1 
IsopropanolTianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured CellsBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. G1262
Oleic acid Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502071
Penicillin StreptomycinGibco15140122
SPSS 24.0Statistics software

Ссылки

  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072 (2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334 (2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238 (2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476 (2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319 (2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287 (2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536 (2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494 (2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287 (2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (4), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489 (2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541 (2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847 (2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255 (2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635 (2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20 (2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены