צינור למחקר אנטומי תלת-ממדי רב-ממדי בקנה מידה של לב האדם

Summary

פרוטוקול זה מציג צינור מקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים המשתרעים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי.

Abstract

מחקר מפורט של לבבות אנושיים שאינם נכשלים ונדחו להשתלה מספק הזדמנות ייחודית לבצע ניתוחים מבניים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי. טכניקות אלה כוללות ניקוי רקמות (הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית (3D) של איברים שסולקו ממס וצביעה אימונוהיסטוכימית. הליכי בדיקה מזוסקופית כוללים דיסקציה סטריאוסקופית וסריקה טומוגרפית מיקרו-ממוחשבת (CT). הליכי בדיקה מקרוסקופיים כוללים דיסקציה גסה, צילום (כולל אנאגליפים ופוטוגרמטריה), CT והדפסה תלת ממדית של הלב המנותח פיזית או כמעט מלאה. לפני בדיקה מקרוסקופית, ניתן לבצע קיבוע זילוח לחץ כדי לשמור על הארכיטקטורה התלת-ממדית ועל המורפולוגיה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית של הלב. היישום של טכניקות אלה בשילוב לחקר הלב האנושי הוא ייחודי וחיוני להבנת הקשר בין תכונות אנטומיות מובהקות כגון כלי דם כליליים ועצבוב שריר הלב בהקשר של ארכיטקטורה תלת ממדית של הלב. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את המתודולוגיות וכולל תוצאות מייצגות כדי להמחיש את ההתקדמות במחקר האנטומיה של הלב האנושי.

Introduction

מכיוון שתפקוד עוקב אחר צורה, הבנת הארכיטקטורה של הלב היא בסיסית להערכת הפיזיולוגיה שלו. למרות שמחקרים רבים גילו אנטומיה לבבית ממיקרו למאקרו ^1,2,3, שאלות רבות נותרו בלתי פתורות, במיוחד אלה הקשורות לאנטומיה של הלב האנושי. הסיבה לכך היא שמחקרים בסיסיים שהתמקדו באנטומיה פונקציונלית השתמשו בדרך כלל בלבבות בעלי חיים ^4,5,6, אשר לעתים קרובות נבדלים מלבבות אנושיים ^1,7,8. יתר על כן, כל מחקר בנפרד, אפי....

Protocol

מחקר זה השתמש בדגימות רקמה לא מזוהות שנאספו מלבבות אנושיים של תורמים שאינם נכשלים ואושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). דגימות נלקחו מלבבות לא כושלים שנדחו להשתלה. הלבבות היו מחוררים בלחץ, קובעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA), וצולמו לפני עיבוד רקמות בשיטות הבאות. .......

Discussion

המחקר הנוכחי מדגים את הצינור המקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים שלמים. תוצאות מייצגות מראות בדיקות אנטומיות בקנה מידה זעיר עד מאקרו המבוצעות באופן שגרתי עבור לב יחיד. מכיוון שדגימת לב אנושית היא יקרה ביותר, גישה רב-ממדית היא אידיאלית ויעילה כדי לא לבזבז חלקים מהדגימה על ידי יישו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN