Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

Summary

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos que abrangem as escalas microscópica e macroscópica.

Abstract

O estudo detalhado de corações humanos sem falha rejeitados para transplante oferece uma oportunidade única de realizar análises estruturais em escalas microscópicas e macroscópicas. Essas técnicas incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente) e coloração imuno-histoquímica. Os procedimentos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica e tomografia computadorizada (TC). Os procedimentos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria), tomografia computadorizada e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro. Antes do exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão pode ser realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração. A aplicação dessas técnicas em combinação para estudar o coração humano é única e crucial para entender a relação entre características anatômicas distintas, como vasculatura coronária e inervação miocárdica, no contexto da arquitetura 3D do coração. Este protocolo descreve as metodologias em detalhes e inclui resultados representativos para ilustrar o progresso na pesquisa da anatomia cardíaca humana.

Introduction

Como a função segue a forma, entender a arquitetura do coração é fundamental para a apreciação de sua fisiologia. Embora inúmeras investigações tenham revelado a anatomia cardíaca de micro a macroescalas ^1,2,3, várias questões permanecem sem solução, especialmente aquelas relacionadas à anatomia cardíaca humana. Isso ocorre em parte porque os estudos básicos com foco na anatomia funcional geralmente utilizaram corações de animais ^4,5,6, que muitas vezes são distintos dos corações hum....

Protocol

Este estudo usou amostras de tecido não identificadas coletadas de corações humanos de doadores sem falha e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). As amostras foram obtidas de corações sem falha que foram rejeitados para transplante. Os corações foram perfundidos por pressão, fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) e fotografados antes do processamento do tecido pelos seguintes métodos. A Figura 1 resume o fluxograma d.......

Discussion

O presente estudo demonstra o pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos inteiros. Os resultados representativos mostram exames anatômicos em micro a macroescala realizados rotineiramente em um único coração. Como uma amostra de coração humano é extremamente preciosa, uma abordagem em várias escalas é ideal e eficaz para não desperdiçar nenhuma parte da amostra aplicando vários protocolos para vários fins, incluindo descoberta em pesquisa científica, melhoria de procedimentos c.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN