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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A purificação de proteínas recombinantes de sistemas vegetais é geralmente desafiada por proteínas vegetais. Este trabalho fornece um método para extrair e purificar efetivamente uma proteína recombinante secretada do apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Abstract

As plantas são um sistema de expressão eucariótico em desenvolvimento que está sendo explorado para produzir proteínas terapêuticas. A purificação de proteínas recombinantes de plantas é uma das etapas mais críticas do processo de produção. Normalmente, as proteínas foram purificadas a partir de proteínas solúveis totais (TSP), e a presença de diversas proteínas intracelulares e citocromos apresenta desafios para as etapas subsequentes de purificação de proteínas. Além disso, a maioria das proteínas terapêuticas, como antígenos e anticorpos, são secretadas para obter glicosilação adequada, e a presença de proteínas incompletamente modificadas leva a estruturas inconsistentes de antígenos ou anticorpos. Este trabalho apresenta um método mais eficaz para obter proteínas recombinantes altamente purificadas do espaço apoplástico vegetal. A proteína fluorescente verde recombinante (GFP) é projetada para ser secretada no apoplasto de Nicotiana benthamiana e é então extraída usando um método de infiltração-centrifugação. O GFP-His do apoplasto extraído é então purificado por cromatografia de afinidade de níquel. Em contraste com os métodos tradicionais do TSP, a purificação do apoplasto produz proteínas recombinantes altamente purificadas. Isso representa uma importante melhoria tecnológica para os sistemas de produção vegetal.

Introduction

Atualmente, várias proteínas terapêuticas recombinantes produzidas em plantas estão em estudo, incluindo anticorpos, vacinas, proteínas bioativas, enzimas e pequenos polipeptídeos 1,2,3,4,5,6. As plantas estão se tornando uma plataforma cada vez mais utilizada para a produção de proteínas terapêuticas devido à sua segurança, baixo custo e capacidade de escalar rapidamente a produção 7,8. A expressão e modificação d....

Protocol

1. Preparação de plantas de N. benthamiana

  1. Coloque os blocos de mudas em uma bandeja, adicione 1 L de água e deixe de molho por aproximadamente 2 h até saturar totalmente.
  2. Polvilhe uniformemente sementes de N. benthamiana do tipo selvagem nos blocos de mudas, cubra com uma tampa e germine por 1 semana. Cultive N. benthamiana em estufa com fotoperíodo de 18 h, 24 °C, 45% de umidade relativa e fertilize a cada 2 semanas........

Representative Results

GFP-His é alvo de secreção no espaço apoplástico de N. benthamiana
A GFP foi clonada no plasmídeo pCAMBIA1300 com um peptídeo sinal N-terminal PR1a para secreção e um His-tag C-terminal para purificação, gerando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). A proteína recombinante foi expressa transitoriamente em N. benthamiana e uma banda de 30 kDa foi detectada por western blot usando anticorpo anti-His 3 dias após a agroinfiltração

Discussion

O uso de plantas para produzir proteínas terapêuticas expandiu-se rapidamente nos últimos anos 1,2,3,4,5,6. Os genes codificadores de proteínas são clonados em vetores de expressão e entregues aos tecidos vegetais por meio de agroinfiltração. Após a produção por células vegetais, as proteínas são purificadas par.......

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084) e pelo Fundo de Apoio ao Projeto de Implantação Chave do Plano de Ação Trienal do Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mesh nylon fine mesh yarnGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubesVazymeTCF00150For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kitVazymeC112-02For clone
FastDigest Sac1NEBR3156SFor clone
FastDigest XbaINEBFD0685For clone
ImageJ 1.5.0//For greyscale analysis
Large filterThermo FisherNESTFor filtering
Laser scanning confocal microscopyLeica SP8For subcellular localization
Ni sepharose excelCytiva10339806For protein purification
Precast protein plus gelYEASEN36246ES10For SDS-PAGE
Small filterNalgene1660045For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076For western blotting
Triton X-100SCR30188928To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pumpZhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company2XZ-2For vacuum infiltration
Vertical mixerHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited companyBE-1200For mixing
β-mercaptoethanolSIGMABCBK8223VTo configure the extraction buffer

References

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