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A purificação de proteínas recombinantes de sistemas vegetais é geralmente desafiada por proteínas vegetais. Este trabalho fornece um método para extrair e purificar efetivamente uma proteína recombinante secretada do apoplasto de Nicotiana benthamiana.
As plantas são um sistema de expressão eucariótico em desenvolvimento que está sendo explorado para produzir proteínas terapêuticas. A purificação de proteínas recombinantes de plantas é uma das etapas mais críticas do processo de produção. Normalmente, as proteínas foram purificadas a partir de proteínas solúveis totais (TSP), e a presença de diversas proteínas intracelulares e citocromos apresenta desafios para as etapas subsequentes de purificação de proteínas. Além disso, a maioria das proteínas terapêuticas, como antígenos e anticorpos, são secretadas para obter glicosilação adequada, e a presença de proteínas incompletamente modificadas leva a estruturas inconsistentes de antígenos ou anticorpos. Este trabalho apresenta um método mais eficaz para obter proteínas recombinantes altamente purificadas do espaço apoplástico vegetal. A proteína fluorescente verde recombinante (GFP) é projetada para ser secretada no apoplasto de Nicotiana benthamiana e é então extraída usando um método de infiltração-centrifugação. O GFP-His do apoplasto extraído é então purificado por cromatografia de afinidade de níquel. Em contraste com os métodos tradicionais do TSP, a purificação do apoplasto produz proteínas recombinantes altamente purificadas. Isso representa uma importante melhoria tecnológica para os sistemas de produção vegetal.
Atualmente, várias proteínas terapêuticas recombinantes produzidas em plantas estão em estudo, incluindo anticorpos, vacinas, proteínas bioativas, enzimas e pequenos polipeptídeos 1,2,3,4,5,6. As plantas estão se tornando uma plataforma cada vez mais utilizada para a produção de proteínas terapêuticas devido à sua segurança, baixo custo e capacidade de escalar rapidamente a produção 7,8. A expressão e modificação d....
1. Preparação de plantas de N. benthamiana
GFP-His é alvo de secreção no espaço apoplástico de N. benthamiana
A GFP foi clonada no plasmídeo pCAMBIA1300 com um peptídeo sinal N-terminal PR1a para secreção e um His-tag C-terminal para purificação, gerando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). A proteína recombinante foi expressa transitoriamente em N. benthamiana e uma banda de 30 kDa foi detectada por western blot usando anticorpo anti-His 3 dias após a agroinfiltração
O uso de plantas para produzir proteínas terapêuticas expandiu-se rapidamente nos últimos anos 1,2,3,4,5,6. Os genes codificadores de proteínas são clonados em vetores de expressão e entregues aos tecidos vegetais por meio de agroinfiltração. Após a produção por células vegetais, as proteínas são purificadas par.......
Este trabalho é apoiado pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084) e pelo Fundo de Apoio ao Projeto de Implantação Chave do Plano de Ação Trienal do Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mesh nylon fine mesh yarn | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | For AWF protein extraction |
50 ml centrifuge tubes | Vazyme | TCF00150 | For centrifuge |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme | C112-02 | For clone |
FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | For clone |
FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | For clone |
ImageJ 1.5.0 | / | / | For greyscale analysis |
Large filter | Thermo Fisher | NEST | For filtering |
Laser scanning confocal microscopy | Leica SP8 | For subcellular localization | |
Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | For protein purification |
Precast protein plus gel | YEASEN | 36246ES10 | For SDS-PAGE |
Small filter | Nalgene | 1660045 | For filtering |
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit | Thermo Fisher | 34076 | For western blotting |
Triton X-100 | SCR | 30188928 | To configure the extraction buffer |
Type rotaryvang vacuum pump | Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company | 2XZ-2 | For vacuum infiltration |
Vertical mixer | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company | BE-1200 | For mixing |
β-mercaptoethanol | SIGMA | BCBK8223V | To configure the extraction buffer |
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