Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

Abstract

התכונה העצבית ההיקפית הנפוצה ביותר של כאב היא סף גירוי נמוך יותר או רגישות יתר של עצבים סופניים מגרעיני השורש הגבי (DRG). אחת הסיבות המוצעות לרגישות יתר זו קשורה לאינטראקציה בין תאי מערכת החיסון ברקמה ההיקפית לבין תאי עצב. מודלים במבחנה סיפקו ידע בסיסי בהבנת האופן שבו מנגנונים אלה גורמים לרגישות יתר של nociceptor. עם זאת, מודלים במבחנה מתמודדים עם האתגר של תרגום יעילות לבני אדם. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותח מודל מבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ואנטומית לתרבית של גרעיני שורש גבי שלמים (DRGs) בשלושה תאים מבודדים בצלחת בת 48 בארות. DRG ראשוניים נקצרים מחולדות בוגרות של Sprague Dawley לאחר המתת חסד הומנית. שורשי עצב עודפים נחתכים, וה- DRG נחתך לגדלים המתאימים לתרבית. לאחר מכן מגדלים DRG בהידרוג'לים טבעיים, המאפשרים צמיחה חזקה בכל התאים. מערכת מרובת תאים זו מציעה בידוד אנטומי רלוונטי של גופי תאי DRG מתאי עצב, סוגי תאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ותכונות מכניות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים עצביים וחיסוניים. לפיכך, פלטפורמת תרבות זו מספקת כלי רב ערך לחקירת אסטרטגיות בידוד טיפוליות, מה שמוביל בסופו של דבר לגישת סינון משופרת לחיזוי כאב.

Introduction

כאב כרוני הוא הגורם המוביל לנכות ולאובדן עבודה ברחבי העולם1. כאב כרוני משפיע על כ -20% מהמבוגרים ברחבי העולם ומטיל נטל חברתי וכלכלי משמעותי2, עם עלויות כוללות המוערכות בין 560 ל -635 מיליארד דולר מדי שנה בארצות הברית3.

התכונה ההיקפית העיקרית המוצגת על ידי חולי כאב כרוני היא סף גירוי נמוך יותר של עצבים, מה שמוביל לכך שמערכת העצבים מגיבה יותר לגירויים 4,5. סף הגירוי הנמוך יכול לגרום לתגובה כואבת לגירוי שלא היה כואב בעבר (אלודיניה) או לתגובה מוגברת לגירוי מכאיב (שיכוך יתר)6. לטיפולים הנוכחיי....

Protocol

קציר DRG בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת נברסקה-לינקולן. נקבות חולדות Sprague Dawley בנות 12 שבועות (~250 גרם) שימשו למחקר. פרטי בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור והרכבה של מכשירים מרובי תאים

.......

Representative Results

הפרוטוקול הנוכחי תיאר טכניקה לקציר ותרבית DRG מחולדות בוגרות של Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC). כפי שניתן לראות באיור 1, DRG שנקצר מחולדות בוגרות נחתך ונחתך ל~0.5 מ"מ. לאחר מכן, ה-DRG החתוך והנחתך הוטמע בהידרוג'ל באזור הסומה של מכשיר MC (איור 2) וגודלו בתרבית במשך 27.......

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקציר DRG בוגרים של Sprague Dawley ולתרבית אותם בהידרוג'לים טבעיים תלת-ממדיים. בניגוד לשיטה זו, גישות אחרות לקצירת DRG מעכברים וחולדות כוללות בידוד עמוד השדרה. עמוד השדרה הנכרת נחתך בחצי, וחוט השדרה מוסר כדי לחשוף DRGs 23,24,25. נזק ?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF (2152065) ופרס הקריירה של NSF (1846857). המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת Wachs בהווה ובעבר על תרומתם לפרוטוקול זה. דיאגרמות באיור 1 נוצרו ב-Biorender.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsFine Science Tools11252-00For trimming and cutting DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclaved)Prepared in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platesVWR82050-892To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single useBD309657
48 well platesGreiner Bio-One677180
60 mm Petri dishFisher ScientificFB0875713ATo hold media for trimming and cutting
Aluminium foilFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044For DRG media
Collagen type IIbidi50205
Curved cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14For dissection
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044For DRG media
Form cureForm Labscuring agent
Form washForm LabsTo wash excess resins off MC
Glass bead sterilizerFisher ScientificNC9531961
Glass vials (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061For DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 resinFormLabsFLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium SaltMilliporeSigma53747Used to make MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR&D Systems344600501
Large blunt-nose scissorsMilitexEG5-26For dissection
Large forceps (serrated tips)Militex9538797For dissection
Large sharp-nosed scissorsFine Science Tools14010-15For dissection
Low Retention pipette tipsFisher Scientific02-707-017For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)Prepared in labN/A85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)R&D Systems556-NG-100For DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022For DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106For DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabTo upload STL file
RatCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D printing MC device
Small sharp-nosed scissorsFine Science Tools14094-11For dissection
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS6014
Straight cup rongeurFine Science Tools16004-16For dissection
Straight edge spring scissorsFine Science Tools15024-10For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003For trimming and cutting DRG
UV lampAnalytik Jena USTo photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)

References

Explore More Articles

DRG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved