A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).
התכונה העצבית ההיקפית הנפוצה ביותר של כאב היא סף גירוי נמוך יותר או רגישות יתר של עצבים סופניים מגרעיני השורש הגבי (DRG). אחת הסיבות המוצעות לרגישות יתר זו קשורה לאינטראקציה בין תאי מערכת החיסון ברקמה ההיקפית לבין תאי עצב. מודלים במבחנה סיפקו ידע בסיסי בהבנת האופן שבו מנגנונים אלה גורמים לרגישות יתר של nociceptor. עם זאת, מודלים במבחנה מתמודדים עם האתגר של תרגום יעילות לבני אדם. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותח מודל מבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ואנטומית לתרבית של גרעיני שורש גבי שלמים (DRGs) בשלושה תאים מבודדים בצלחת בת 48 בארות. DRG ראשוניים נקצרים מחולדות בוגרות של Sprague Dawley לאחר המתת חסד הומנית. שורשי עצב עודפים נחתכים, וה- DRG נחתך לגדלים המתאימים לתרבית. לאחר מכן מגדלים DRG בהידרוג'לים טבעיים, המאפשרים צמיחה חזקה בכל התאים. מערכת מרובת תאים זו מציעה בידוד אנטומי רלוונטי של גופי תאי DRG מתאי עצב, סוגי תאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ותכונות מכניות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים עצביים וחיסוניים. לפיכך, פלטפורמת תרבות זו מספקת כלי רב ערך לחקירת אסטרטגיות בידוד טיפוליות, מה שמוביל בסופו של דבר לגישת סינון משופרת לחיזוי כאב.
כאב כרוני הוא הגורם המוביל לנכות ולאובדן עבודה ברחבי העולם1. כאב כרוני משפיע על כ -20% מהמבוגרים ברחבי העולם ומטיל נטל חברתי וכלכלי משמעותי2, עם עלויות כוללות המוערכות בין 560 ל -635 מיליארד דולר מדי שנה בארצות הברית3.
התכונה ההיקפית העיקרית המוצגת על ידי חולי כאב כרוני היא סף גירוי נמוך יותר של עצבים, מה שמוביל לכך שמערכת העצבים מגיבה יותר לגירויים 4,5. סף הגירוי הנמוך יכול לגרום לתגובה כואבת לגירוי שלא היה כואב בעבר (אלודיניה) או לתגובה מוגברת לגירוי מכאיב (שיכוך יתר)6. לטיפולים הנוכחיי....
קציר DRG בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת נברסקה-לינקולן. נקבות חולדות Sprague Dawley בנות 12 שבועות (~250 גרם) שימשו למחקר. פרטי בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. ייצור והרכבה של מכשירים מרובי תאים
.......הפרוטוקול הנוכחי תיאר טכניקה לקציר ותרבית DRG מחולדות בוגרות של Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC). כפי שניתן לראות באיור 1, DRG שנקצר מחולדות בוגרות נחתך ונחתך ל~0.5 מ"מ. לאחר מכן, ה-DRG החתוך והנחתך הוטמע בהידרוג'ל באזור הסומה של מכשיר MC (איור 2) וגודלו בתרבית במשך 27.......
פרוטוקול זה מתאר שיטה לקציר DRG בוגרים של Sprague Dawley ולתרבית אותם בהידרוג'לים טבעיים תלת-ממדיים. בניגוד לשיטה זו, גישות אחרות לקצירת DRG מעכברים וחולדות כוללות בידוד עמוד השדרה. עמוד השדרה הנכרת נחתך בחצי, וחוט השדרה מוסר כדי לחשוף DRGs 23,24,25. נזק ?.......
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF (2152065) ופרס הקריירה של NSF (1846857). המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת Wachs בהווה ובעבר על תרומתם לפרוטוקול זה. דיאגרמות באיור 1 נוצרו ב-Biorender.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 - 7.5 pH | |
24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
Form cure | Form Labs | curing agent | |
Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 - 115 % methacrylation |
Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
Rat | Charles River | ||
Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved