קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

Summary

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

Abstract

התכונה העצבית ההיקפית הנפוצה ביותר של כאב היא סף גירוי נמוך יותר או רגישות יתר של עצבים סופניים מגרעיני השורש הגבי (DRG). אחת הסיבות המוצעות לרגישות יתר זו קשורה לאינטראקציה בין תאי מערכת החיסון ברקמה ההיקפית לבין תאי עצב. מודלים במבחנה סיפקו ידע בסיסי בהבנת האופן שבו מנגנונים אלה גורמים לרגישות יתר של nociceptor. עם זאת, מודלים במבחנה מתמודדים עם האתגר של תרגום יעילות לבני אדם. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותח מודל מבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ואנטומית לתרבית של גרעיני שורש גבי שלמים (DRGs) בשלושה תאים מבודדים בצלחת בת 48 בארות. DRG ראשוניים נקצרים מחולדות בוגרות של Sprague Dawley לאחר המתת חסד הומנית. שורשי עצב עודפים נחתכים, וה- DRG נחתך לגדלים המתאימים לתרבית. לאחר מכן מגדלים DRG בהידרוג'לים טבעיים, המאפשרים צמיחה חזקה בכל התאים. מערכת מרובת תאים זו מציעה בידוד אנטומי רלוונטי של גופי תאי DRG מתאי עצב, סוגי תאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ותכונות מכניות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים עצביים וחיסוניים. לפיכך, פלטפורמת תרבות זו מספקת כלי רב ערך לחקירת אסטרטגיות בידוד טיפוליות, מה שמוביל בסופו של דבר לגישת סינון משופרת לחיזוי כאב.

Introduction

כאב כרוני הוא הגורם המוביל לנכות ולאובדן עבודה ברחבי העולם¹. כאב כרוני משפיע על כ -20% מהמבוגרים ברחבי העולם ומטיל נטל חברתי וכלכלי משמעותי², עם עלויות כוללות המוערכות בין 560 ל -635 מיליארד דולר מדי שנה בארצות הברית³.

התכונה ההיקפית העיקרית המוצגת על ידי חולי כאב כרוני היא סף גירוי נמוך יותר של עצבים, מה שמוביל לכך שמערכת העצבים מגיבה יותר לגירויים ^4,5. סף הגירוי הנמוך יכול לגרום לתגובה כואבת לגירוי שלא היה כואב בעבר (אלודיניה) או לתגובה מוגברת לגירוי מכאיב (שיכוך יתר)⁶. לטיפולים הנוכחיי....

Protocol

קציר DRG בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת נברסקה-לינקולן. נקבות חולדות Sprague Dawley בנות 12 שבועות (~250 גרם) שימשו למחקר. פרטי בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור והרכבה של מכשירים מרובי תאים

.......

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקציר DRG בוגרים של Sprague Dawley ולתרבית אותם בהידרוג'לים טבעיים תלת-ממדיים. בניגוד לשיטה זו, גישות אחרות לקצירת DRG מעכברים וחולדות כוללות בידוד עמוד השדרה. עמוד השדרה הנכרת נחתך בחצי, וחוט השדרה מוסר כדי לחשוף DRGs 23,24,25. נזק ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-00	For trimming and cutting DRG
10x DMEM	MilliporeSigma	D2429
1x PBS (autoclaved)	Prepared in lab		7.3 - 7.5 pH
24 well plates	VWR	82050-892	To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single use	BD	309657
48 well plates	Greiner Bio-One	677180
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	To hold media for trimming and cutting
Aluminium foil	Fisherbrand	01-213-104
B27 Plus 50x	ThermoFisher	17504044	For DRG media
Collagen type I	Ibidi	50205
Curved cup Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16221-14	For dissection
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools	11293-00	For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044	For DRG media
Form cure	Form Labs		curing agent
Form wash	Form Labs		To wash excess resins off MC
Glass bead sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Glass vials (8 mL)	DWK Life Sciences (Wheaton)	224724
GlutaMax	ThermoFisher	35050-061	For DRG media
HEPES (1M)	Millipore Sigma	H0887
High temp V2 resin	FormLabs	FLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium Salt	MilliporeSigma	53747	Used to make MAHA
Irgacure	MilliporeSigma	410896
Laminin	R&D Systems	344600501
Large blunt-nose scissors	Militex	EG5-26	For dissection
Large forceps (serrated tips)	Militex	9538797	For dissection
Large sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14010-15	For dissection
Low Retention pipette tips	Fisher Scientific	02-707-017	For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)	Prepared in lab	N/A	85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	556-NG-100	For DRG media
Neurobasal A Media	ThermoFisher	10888022	For DRG media
Parafilm	Bemis	PM996
Parafilm	Bemis	PM996
Penicillin/Streptomycin (PS)	EMD Millipore	516106	For DRG media
pH test strips	VWR International	BDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)	USA Scientific	1111-2021
Preform 3.23.1 software	Formslab		To upload STL file
Rat	Charles River
Resin 3D printer	Form Labs	Form 3L	3D printing MC device
Small sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14094-11	For dissection
Sodium bicarbonate	MilliporeSigma	S6014
Straight cup rongeur	Fine Science Tools	16004-16	For dissection
Straight edge spring scissors	Fine Science Tools	15024-10	For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)	Fisher Scientific	22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)	Celltreat	229747
Tiny spring scissors	World Precision Instruments	14003	For trimming and cutting DRG
UV lamp	Analytik Jena US		To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)