从小鼠大脑和颅骨中分离免疫细胞

Summary

为了研究对脑部疾病的免疫反应，一种常见的方法是分析免疫细胞的变化。在这里，提供了两种简单有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。

Abstract

越来越多的证据表明，由脑部疾病（例如脑缺血和自身免疫性脑脊髓炎）引发的免疫反应不仅发生在大脑中，还发生在颅骨中。分析脑损伤（例如中风）后大脑和颅骨骨髓中免疫细胞群变化的关键步骤是获得足够数量的高质量免疫细胞用于下游分析。这里提供了两种优化的方案，用于从大脑和颅骨骨髓中分离免疫细胞。这两种方案的优势都体现在它们的简单性、速度和产生大量活免疫细胞的有效性上。这些细胞可能适用于一系列下游应用，例如细胞分选、流式细胞术和转录组学分析。为了证明方案的有效性，使用流式细胞术分析对中风脑和正常脑颅骨骨髓进行了免疫表型实验，结果与已发表的研究结果一致。

Introduction

大脑是神经系统的中枢，受到颅骨的保护。颅骨下方是三层结缔组织，称为脑膜——硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑脊液 （CSF） 在蛛网膜基质和软脑膜之间的蛛网膜下腔循环，缓冲大脑并通过淋巴系统清除废物 ^1,2。总之，这种独特的架构提供了一个安全和支持性的环境，可以维持大脑的稳定性并保护它免受潜在的伤害。

长期以来，大脑一直被认为是免疫特权的。然而，这一概念已被部分放弃，因为越来越多的证据表明，除了薄壁组织中的常驻小胶质细胞外，大脑的边界，包括脉络丛和脑膜，还承载着多种免疫细胞³。这些细胞在维持体内平衡、监测大脑健康和启动对脑损伤的免疫反应方面起着关键作用。值得注意的是，最近的研究结果表明，颅骨参与脑膜免疫，并可能有助于受伤后大脑的免疫反应。2018 年，Herisson 等人开创性地发现了连接颅骨骨髓和脑膜的直接血管通道，从而建立了白细胞迁移的解剖途径 ^4,5。后来，Cugurra 等人证明，脑膜中的许多髓系细胞（例如单核细胞和中性粒细胞）和 B 细胞并非源自血液⁶。使用颅骨皮瓣移植和选择性照射方案等技术，作者提供了令人信服的证据，证明颅骨骨髓是脑膜中髓系细胞....

Protocol

该协议得到了杜克研究所动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用雄性 C57Bl/6 小鼠 （3-4 个月大;22-28 g）。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 小鼠脑单细胞悬液

注意： 图 1 说明了脑细胞分离方案的概述。

1. 麻醉、插管和固定小鼠，如前所述¹¹.
2. 在皮肤.......

Discussion

在这里，提出了两种简单而有效的方案，用于从大脑和颅骨骨髓中分离免疫细胞。这些方案可以可靠地产生大量活的免疫细胞，这些细胞可能适用于不同的下游应用，特别是流式细胞术。

为了研究各种脑部疾病中的神经炎症，已经建立了许多来自大脑的免疫细胞制备方案，并在不同的实验室中使用 15,16,17。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544