Isolando células imunes do cérebro e crânio de camundongos

Summary

Para investigar a resposta imune a distúrbios cerebrais, uma abordagem comum é analisar as mudanças nas células imunológicas. Aqui, dois protocolos simples e eficazes são fornecidos para isolar células imunes do tecido cerebral murino e da medula óssea do crânio.

Abstract

Evidências crescentes indicam que a resposta imune desencadeada por distúrbios cerebrais (por exemplo, isquemia cerebral e encefalomielite autoimune) ocorre não apenas no cérebro, mas também no crânio. Um passo fundamental para analisar as mudanças nas populações de células imunes no cérebro e na medula óssea do crânio após danos cerebrais (por exemplo, acidente vascular cerebral) é obter um número suficiente de células imunes de alta qualidade para análises posteriores. Aqui, dois protocolos otimizados são fornecidos para isolar células imunes do cérebro e da medula óssea do crânio. As vantagens de ambos os protocolos se refletem em sua simplicidade, velocidade e eficácia na produção de uma grande quantidade de células imunes viáveis. Essas células podem ser adequadas para uma variedade de aplicações downstream, como classificação de células, citometria de fluxo e análise transcriptômica. Para demonstrar a eficácia dos protocolos, experimentos de imunofenotipagem foram realizados em cérebros de AVC e medula óssea de crânio cerebral normal usando análise de citometria de fluxo, e os resultados se alinharam com os achados de estudos publicados.

Introduction

O cérebro, o centro do sistema nervoso, é protegido pelo crânio. Abaixo do crânio estão três camadas de tecido conjuntivo conhecidas como meninges - dura-máter, aracnóide e pia-máter. O líquido cefalorraquidiano (LCR) circula no espaço subaracnóideo entre a aracnóide e a pia-máter, amortecendo o cérebro e também removendo os resíduos pelo sistema glinfático ^1,2. Juntos, essa arquitetura exclusiva fornece um ambiente seguro e de suporte que mantém a estabilidade do cérebro e o protege de possíveis lesões.

O cérebro há muito é considerado imunoprivilegiado. No entanto, essa noção foi ....

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Duke Institute (IACUC). Camundongos C57Bl/6 machos (3-4 meses de idade; 22-28 g) foram usados no presente estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Suspensão unicelular do cérebro do camundongo

NOTA: A Figura 1 ilustra a visão geral do protocolo de isolamento de células c.......

Discussion

Aqui, dois protocolos simples, mas eficazes, são apresentados para isolar células imunes do cérebro e da medula óssea do crânio. Esses protocolos podem produzir de forma confiável uma grande quantidade de células imunes viáveis que podem ser adequadas para diversas aplicações a jusante, em particular para citometria de fluxo.

Para estudar a neuroinflamação em vários distúrbios cerebrais, muitos protocolos para preparações de células imunes do cérebro foram estabelecidos e usa.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544