Выделение иммунных клеток из мозга и черепа мыши

Summary

Для изучения иммунного ответа на расстройства мозга одним из распространенных подходов является анализ изменений в иммунных клетках. Здесь представлены два простых и эффективных протокола для выделения иммунных клеток из ткани мозга мыши и костного мозга черепа.

Abstract

Все больше данных указывает на то, что иммунный ответ, вызванный нарушениями работы мозга (например, ишемией мозга и аутоиммунным энцефаломиелитом), происходит не только в мозге, но и в черепе. Ключевым шагом на пути к анализу изменений в популяциях иммунных клеток как в головном мозге, так и в костном мозге черепа после повреждения головного мозга (например, инсульта) является получение достаточного количества высококачественных иммунных клеток для последующего анализа. В данном случае предлагаются два оптимизированных протокола для выделения иммунных клеток из головного мозга и костного мозга черепа. Преимущества обоих протоколов заключаются в их простоте, скорости и эффективности в получении большого количества жизнеспособных иммунных клеток. Эти клетки могут быть пригодны для ряда последующих применений, таких как сортировка клеток, проточная цитометрия и транскриптомный анализ. Чтобы продемонстрировать эффективность протоколов, были проведены эксперименты по иммунофенотипированию на головном мозге, перенесшем инсульт, и нормальном мозге, черепе, костном мозге с использованием анализа проточной цитометрии, и результаты согласуются с результатами опубликованных исследований.

Introduction

Мозг, центральный узел нервной системы, защищен черепом. Под черепом находятся три слоя соединительной ткани, известные как мозговые оболочки - твердая мозговая оболочка, паутинная оболочка и мягкая мозговая оболочка. Спинномозговая жидкость (ликвор) циркулирует в субарахноидальном пространстве между паутинной оболочкой и мозговой оболочкой, смягчая работу мозга и выводя отходы через глимфатическую систему ^1,2. В совокупности эта уникальная архитектура обеспечивает безопасную и благоприятную среду, которая поддерживает стабильность мозга и защищает его от потенциальных травм.

Мозг д....

Protocol

Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института Дьюка. В данном исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6 (в возрасте 3-4 месяцев; 22-28 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

Discussion

Здесь представлены два простых, но эффективных протокола для выделения иммунных клеток из мозга и костного мозга черепа. Эти протоколы могут надежно получать большое количество жизнеспособных иммунных клеток, которые могут быть пригодны для различных последующих применений, в частно.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544