A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כימות הרמה של 8-oxo-dG באמצעות בדיקת ELISA להערכת נזק חמצוני לדנ"א בתאי MCF-7
In This Article
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לגילוי כמותי של נזקי חמצון בתאי MCF-7 בטכנולוגיית ELISA.
Abstract
בסיס 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) הוא הצורה השלטת של נזק חמצוני DNA נפוץ. פגיעה בדנ"א משפיעה עמוקות על ביטוי גנים ומשמשת גורם מרכזי בגירוי הפרעות נוירודגנרטיביות, סרטן והזדקנות. לכן, לכימות מדויק של 8-oxoG יש משמעות קלינית בחקירת מתודולוגיות זיהוי נזקי DNA. עם זאת, כיום, הגישות הקיימות לזיהוי 8-oxoG מציבות אתגרים במונחים של נוחות, תועלתיות, מחיר סביר ורגישות מוגברת. השתמשנו בטכניקת ELISA (Marketing), שיטה קולורימטרית יעילה ומהירה ביותר, כדי לזהות שינויים בתכולת 8-oxo-dG בדגימות תאים MCF-7 שעוררו בריכוזים שונים של מי חמצן (H2O2). קבענו את הריכוז של H2O2 שגרם לנזק חמצוני בתאי MCF-7 על ידי זיהוי ערך IC50 שלו בתאי MCF-7. לאחר מכן, טיפלנו בתאי MCF-7 עם 0, 0.25 ו-0.75 mM H2O2 במשך 12 שעות וחילצנו 8-oxo-dG מהתאים. לבסוף, הדגימות היו חשופות ELISA. לאחר סדרה של שלבים, כולל פיזור לוחות, שטיפה, דגירה, התפתחות צבע, סיום התגובה ואיסוף נתונים, זיהינו בהצלחה שינויים בתכולת 8-oxo-dG בתאי MCF-7 המושרים על ידי H2O2. באמצעות מאמצים כאלה, אנו שואפים לבסס שיטה להערכת מידת הנזק החמצוני של דנ"א בתוך דגימות תאים, ובכך לקדם את הפיתוח של גישות יעילות ונוחות יותר לזיהוי נזק לדנ"א. מאמץ זה צפוי לתרום תרומה משמעותית לחקר ניתוחים אסוציאטיביים בין נזק חמצוני לדנ"א לבין תחומים שונים, כולל מחקר קליני על מחלות ואיתור חומרים רעילים.
Introduction
נזק חמצוני לדנ"א הוא תוצאה של חוסר איזון בין יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) לבין מערכת ההגנה נוגדת החמצון התאית1. זה בעיקר כרוך חמצון של DNA purine ו pyrimidine בסיסים 2,3. שינוי חמצוני זה של בסיסי דנ"א לא רק פוגע בשלמות הגנום, אלא גם מקיף מגוון רחב של בעיות פתולוגיות, כולל סרטן, מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות לב וכלי דם 4,5. בסיס הגואנין בדנ"א הוא בעל פוטנציאל החיזור הנמוך ביותר והוא הרגיש ביותר לחמצון6. לכן, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) משמש כסמן עיקרי להערכת מידת הנזק החמצוני לדנ"א
Protocol
1. בנייתמודל נזק חמצוני של DNA המושרה H2O2 בתאי MCF-7
- שחזור תאי MCF-7
- העבירו את הצינור הקריוגני של תרבית התא, המכיל 3.5 x 106 תאי MCF-7 ומאוחסן במקרר -80°C, במהירות לקופסת קצף המכילה חנקן נוזלי. שלפו את הצינור בעזרת מלקחיים והניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה קבועה ש.......
Representative Results
כפי שמודגם באיור 3, ציר ה-X מציין את הריכוז של H2O2 המופעל על תאי MCF-7, בעוד שציר ה-Y מציין את יכולת הקיום של התא. טיפול עם 0.75 mM במשך 12 שעות הפחית את הכדאיות של תאי MCF-7 ל 67%. במקביל לעלייה בריכוז, חלה ירידה משמעותית בכדאיות תאי MCF-7, במיוחד בריכוז של 1.5 מילימול, שם הכדאיות ירד.......
Discussion
לפיתוח שיטות ELISA חשיבות רבה עבור מתודולוגיות קיימות וחדשות לזיהוי נזקי DNA. בהשוואה לטכניקות HPLC מסורתיות וספקטרומטריית מסות, גישה זו לא רק ידידותית למשתמש אלא גם מפגינה רגישות גבוהה ועונה על הדרישות של סינוןבתפוקה גבוהה 30. זה מאפשר ניטור של 8-oxo-dG במחקרי סינון מחלות בקנה מידה גד?.......
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי צוות המחקר החדשני של מכון ג'יאנגסו להשכלה גבוהה למדע וטכנולוגיה (2021), תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי ההנדסי של המכללה המקצועית ג'יאנגסו (2023), תוכנית טכנולוגית מפתח של פרויקטים טכנולוגיים לפרנסת אנשי סוג'ואו (SKY2021029), פרויקט פתוח של ג'יאנגסו ביובנק למשאבים קליניים (TC2021B009), פרויקט מעבדת מפתח המדינה לרפואת קרינה והגנה, אוניברסיטת סוצ'ו (GZK12023013), תוכניות של המכללה לבריאות מקצועית סוג'ואו (SZWZYTD202201), ופרויקט צ'ינג-לאן של מחוז ג'יאנגסו בסין (2021, 2022).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA(1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Cell Counting Plate | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 incubator | Thermo | 51032872 | |
| DMEM basic(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | GraphPad Software | statistical analysis software | |
| H2O2(3%) | Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd. | 1028348 | |
| high-speed centrifuge | Thermo | 9AQ2861 | |
| Human 8-oxo-dG ELISA Kit | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipettes | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipettes | Rainin | 17014392 | |
| liquid nitrogen tank | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Multiskan FC microplate photometer | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Trinocular live cell microscope | Motic | 1.1001E+12 | |
| Ultra-low temperature freezer | Haire | V118574 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved