Количественная оценка уровня 8-оксо-dG с помощью ИФА-анализа для оценки окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7

Summary

Этот протокол описывает эффективный метод количественного обнаружения окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7 с помощью технологии ИФА.

Abstract

Основание 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозина (8-оксо-dG) является преобладающей формой часто наблюдаемого окислительного повреждения ДНК. Нарушение ДНК глубоко влияет на экспрессию генов и служит ключевым фактором в стимулировании нейродегенеративных расстройств, рака и старения. Таким образом, точное количественное определение 8-oxoG имеет клиническое значение при исследовании методологий обнаружения повреждений ДНК. Тем не менее, в настоящее время существующие подходы к обнаружению 8-oxoG создают проблемы с точки зрения удобства, целесообразности, доступности и повышенной чувствительности. Мы использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА), высокоэффективный и быстрый колориметрический метод, для выявления вариаций содержания 8-оксо-dG в образцах клеток MCF-7, стимулированных различными концентрациями перекиси водорода (H₂O₂). Мы определили концентрацию_H2,_O2 , которая индуцировала окислительное повреждение в клетках MCF-7, обнаружив значение IC₅₀ в клетках MCF-7. Впоследствии мы обрабатывали клетки MCF-7 0, 0,25 и 0,75 мМ_Н2О₂ в течение 12 ч и извлекали из клеток 8-оксо-dG. Наконец, образцы были подвергнуты ИФА. После ряда этапов, включая раскладывание планшетов, промывку, инкубацию, развитие цвета, окончание реакции и сбор данных, мы успешно обнаружили изменения в содержании 8-оксо-dG в клетках MCF-7, индуцированные H₂O₂. С помощью таких усилий мы стремимся создать метод оценки степени окислительного повреждения ДНК в образцах клеток и, таким образом, продвинуть разработку более целесообразных и удобных подходов к обнаружению повреждений ДНК. Это начинание призвано внести значимый вклад в изучение ассоциативного анализа между окислительным повреждением ДНК и различными областями, включая клинические исследования заболеваний и обнаружение токсичных веществ.

Introduction

Окислительное повреждение ДНК является следствием дисбаланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и клеточной системой антиоксидантной защиты¹. В первую очередь он включает в себя окисление ДНК пуриновых и пиримидиновых оснований ^2,3. Эта окислительная модификация оснований ДНК не только нарушает целостность генома, но и охватывает широкий спектр патологических проблем, включая рак, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые^{заболевания.} Основание гуанина в ДНК имеет самый низкий восстановительный потенциал....

Protocol

1. Построениемодели H₂O₂ -индуцированного окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7

1. Восстановление клеток MCF-7
   1. Быстро перенесите криогенную пробирку для клеточной культуры, которая содержит 3,5 x 10⁶ клеток MCF-7 и хранится в холодильнике при тем.......

Discussion

Развитие методов ИФА имеет большое значение как для существующих, так и для новых методик обнаружения повреждений ДНК. По сравнению с традиционными методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии, этот подход не только удобен в использовании, но и обладает высокой чувствительностью и отвечает треб.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
H2O2(3%)	Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd.	1028348
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574