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Il presente protocollo descrive le misure di pH in organoidi gastrici derivati da tessuti umani utilizzando microelettrodi per la caratterizzazione spazio-temporale della fisiologia intraluminale.
L'ottimizzazione e la caratterizzazione dettagliata dei modelli di organoidi gastrointestinali richiedono metodi avanzati per l'analisi dei loro ambienti luminali. Questo articolo presenta un metodo altamente riproducibile per la misurazione precisa del pH all'interno della lumina di organoidi gastrici umani 3D tramite microelettrodi controllati da micromanipolatore. I microelettrodi di pH sono disponibili in commercio e sono costituiti da punte di vetro smussate di 25 μm di diametro. Per le misurazioni, il microelettrodo di pH viene fatto avanzare nel lume di un organoide (>200 μm) sospeso in Matrigel, mentre un elettrodo di riferimento rimane immerso nel terreno circostante nella piastra di coltura.
Utilizzando tali microelettrodi per profilare organoidi derivati dal corpo gastrico umano, dimostriamo che il pH luminale è relativamente coerente all'interno di ciascun pozzetto di coltura a ~7,7 ± 0,037 e che le misurazioni continue possono essere ottenute per un minimo di 15 minuti. In alcuni organoidi più grandi, le misurazioni hanno rivelato un gradiente di pH tra la superficie epiteliale e il lume, suggerendo che le misure di pH negli organoidi possono essere ottenute con un'alta risoluzione spaziale. In uno studio precedente, i microelettrodi sono stati utilizzati con successo per misurare le concentrazioni di ossigeno luminale negli organoidi, dimostrando la versatilità di questo metodo per l'analisi degli organoidi. In sintesi, questo protocollo descrive un importante strumento per la caratterizzazione funzionale dello spazio luminale complesso all'interno di organoidi 3D.
Gli organoidi – strutture multicellulari in miniatura derivate da cellule staminali – hanno rivoluzionato la nostra capacità di studiare la fisiologia umana e stanno iniziando a sostituire i modelli animali, anche in contesti normativi1. Dalla descrizione iniziale degli organoidi intestinali da parte di Sato et al. nel 2009, la tecnologia degli organoidi è diventata immensamente popolare2. Un gran numero di studi ha caratterizzato la composizione cellulare e la funzione dei modelli di organoidi in grande dettaglio 3,4,5,6.<....
Questo protocollo richiede organoidi 3D di almeno 200 μm di diametro che abbiano un lume distinto e che siano incorporati in una matrice extracellulare artificiale (ECM, ad es. Matrigel). I tessuti gastrici umani per la derivazione di organoidi sono stati ottenuti con l'approvazione dell'Institutional Review Board della Montana State University e il consenso informato di pazienti sottoposti a endoscopia superiore presso Bozeman Health (protocollo # 2023-48-FCR, a D.B.) o come campioni esenti di gastrectomia a stomaco in.......
La secrezione di acido è una funzione cruciale dello stomaco umano. Tuttavia, fino a che punto la secrezione acida possa essere modellata negli organoidi è ancora oggetto di dibattito 6,32,33,34. Abbiamo quindi sviluppato il protocollo sopra descritto per misurare con precisione la produzione di acido negli organoidi gastrici. In particolare, abbiamo utilizzato organoidi derivati da cellule s.......
L'accesso limitato allo spazio luminale degli organoidi ha fortemente limitato la nostra comprensione delle dinamiche fisiologiche di questo microambiente. Uno strumento affidabile per le analisi funzionali della fisiologia luminale amplierà la nostra capacità di sfruttare gli organoidi come modelli in vitro per la fisiologia, la farmacologia e la ricerca sulle malattie. Gli organoidi sono modelli altamente sintonizzabili e fisiologicamente rilevanti con il potenziale aggiunto di replicare la variabilità gene.......
Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Ellen Lauchnor, il dott. Phil Stewart e Bengisu Kilic per il loro precedente lavoro e l'assistenza con i microsensori O2 ; Andy Sebrell per la formazione in coltura di organoidi e micromanipolazione; Lexi Burcham per l'assistenza nella coltura degli organoidi, nella preparazione dei terreni, nella registrazione dei dati e nell'organizzazione; e la dottoressa Susy Kohout per consigli generali in elettrofisiologia. Vorremmo ringraziare la dottoressa Heidi Smith per la sua assistenza con l'imaging e riconoscere il Centro per l'ingegneria del biofilm Bioimaging Facility presso la Montana State University, che è supp....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 M KCl | Unisense | ||
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229091B | |
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229092B | |
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229412 | |
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile | CellTreat | 229124 | |
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229093B | |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229422 | |
70% Ethanol | BP82031GAL | BP82031GAL | |
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile | CellTreat | 229483 | |
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile | CellTreat | 229037 | |
Amphotericin B (Fungizone) Solution | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | Class II Type A/B3 |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | Cell dissociation solution |
DMEM/F-12 (Advanced DMEM) | Gibco | 12-491-015 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
Fetal Bovine Serum | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
G418 Sulfate | Corning | 30-234-CR | |
Gentamycin sulfate | IBI Scientific | IB02030 | |
HEPES, Free Acid | Cytiva | SH30237.01 | |
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144C-212 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11676604 | |
iPhone 12 camera | Apple | ||
L-glutamine | Cytiva | SH3003401 | |
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 34133 | |
M 205 FA Stereomicroscope | Leica | ||
Matrigel Membrane Matrix 354234 | Corning | CB-40234 | |
MC-1 UniMotor Controller | Unisense | ||
Methyl red | |||
MM33 Micromanipulator | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | Right handed |
MS-15 Motorized Stage | Unisense | ||
Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | nanoliter autoinjector |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
pH Microelectrodes | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
Reference Electrode | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
Smartphone Camera Adapter | Gosky | ||
Specifications Laboratory Stand LS | Unisense | LS-009238 | |
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red | Gibco | 25-200-056 | |
UniAmp | Unisense | 11632 | |
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
µSensor Calibration Kit | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets |
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