Profilazione del pH luminale in organoidi gastrointestinali tridimensionali mediante microelettrodi

Summary

Il presente protocollo descrive le misure di pH in organoidi gastrici derivati da tessuti umani utilizzando microelettrodi per la caratterizzazione spazio-temporale della fisiologia intraluminale.

Abstract

L'ottimizzazione e la caratterizzazione dettagliata dei modelli di organoidi gastrointestinali richiedono metodi avanzati per l'analisi dei loro ambienti luminali. Questo articolo presenta un metodo altamente riproducibile per la misurazione precisa del pH all'interno della lumina di organoidi gastrici umani 3D tramite microelettrodi controllati da micromanipolatore. I microelettrodi di pH sono disponibili in commercio e sono costituiti da punte di vetro smussate di 25 μm di diametro. Per le misurazioni, il microelettrodo di pH viene fatto avanzare nel lume di un organoide (>200 μm) sospeso in Matrigel, mentre un elettrodo di riferimento rimane immerso nel terreno circostante nella piastra di coltura.

Utilizzando tali microelettrodi per profilare organoidi derivati dal corpo gastrico umano, dimostriamo che il pH luminale è relativamente coerente all'interno di ciascun pozzetto di coltura a ~7,7 ± 0,037 e che le misurazioni continue possono essere ottenute per un minimo di 15 minuti. In alcuni organoidi più grandi, le misurazioni hanno rivelato un gradiente di pH tra la superficie epiteliale e il lume, suggerendo che le misure di pH negli organoidi possono essere ottenute con un'alta risoluzione spaziale. In uno studio precedente, i microelettrodi sono stati utilizzati con successo per misurare le concentrazioni di ossigeno luminale negli organoidi, dimostrando la versatilità di questo metodo per l'analisi degli organoidi. In sintesi, questo protocollo descrive un importante strumento per la caratterizzazione funzionale dello spazio luminale complesso all'interno di organoidi 3D.

Introduction

Gli organoidi – strutture multicellulari in miniatura derivate da cellule staminali – hanno rivoluzionato la nostra capacità di studiare la fisiologia umana e stanno iniziando a sostituire i modelli animali, anche in contesti normativi¹. Dalla descrizione iniziale degli organoidi intestinali da parte di Sato et al. nel 2009, la tecnologia degli organoidi è diventata immensamente popolare². Un gran numero di studi ha caratterizzato la composizione cellulare e la funzione dei modelli di organoidi in grande dettaglio 3,4,5,6.^<....

Protocol

Questo protocollo richiede organoidi 3D di almeno 200 μm di diametro che abbiano un lume distinto e che siano incorporati in una matrice extracellulare artificiale (ECM, ad es. Matrigel). I tessuti gastrici umani per la derivazione di organoidi sono stati ottenuti con l'approvazione dell'Institutional Review Board della Montana State University e il consenso informato di pazienti sottoposti a endoscopia superiore presso Bozeman Health (protocollo # 2023-48-FCR, a D.B.) o come campioni esenti di gastrectomia a stomaco in.......

Discussion

L'accesso limitato allo spazio luminale degli organoidi ha fortemente limitato la nostra comprensione delle dinamiche fisiologiche di questo microambiente. Uno strumento affidabile per le analisi funzionali della fisiologia luminale amplierà la nostra capacità di sfruttare gli organoidi come modelli in vitro per la fisiologia, la farmacologia e la ricerca sulle malattie. Gli organoidi sono modelli altamente sintonizzabili e fisiologicamente rilevanti con il potenziale aggiunto di replicare la variabilità gene.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets