Профилирование рН люминала в трехмерных органоидах желудочно-кишечного тракта с помощью микроэлектродов

Summary

В настоящем протоколе описаны измерения рН в органоидах желудка человека, полученных из тканей человека, с использованием микроэлектродов для пространственно-временной характеристики внутрипросветной физиологии.

Abstract

Оптимизация и детальная характеристика моделей органоидов желудочно-кишечного тракта требуют передовых методов анализа их люминального окружения. В данной работе представлен высоковоспроизводимый метод точного измерения рН в просвете 3D-органоидов желудка человека с помощью микроэлектродов, управляемых микроманипуляторами. Микроэлектроды pH коммерчески доступны и состоят из скошенных стеклянных наконечников диаметром 25 мкм. Для измерений pH-микроэлектрод продвигается в просвет органоида (>200 мкм), взвешенного в Matrigel, в то время как электрод сравнения погружается в окружающую среду в культуральной пластине.

Используя такие микроэлектроды для профилирования органоидов, полученных из желудочного тела человека, мы демонстрируем, что рН люминала относительно постоянен в каждой культуральной лунке на уровне ~7,7 ± 0,037 и что непрерывные измерения могут быть получены в течение как минимум 15 минут. В некоторых крупных органоидах измерения выявили градиент pH между поверхностью эпителия и просветом, что позволяет предположить, что измерения pH в органоидах могут быть достигнуты с высоким пространственным разрешением. В предыдущем исследовании микроэлектроды были успешно использованы для измерения концентрации кислорода в органоидах в люминате, что продемонстрировало универсальность этого метода для анализа органоидов. Таким образом, этот протокол описывает важный инструмент для функциональной характеристики сложного просветного пространства внутри 3D-органоидов.

Introduction

Органоиды — миниатюрные многоклеточные структуры, полученные из стволовых клеток, — произвели революцию в изучении физиологии человека и начинают заменять животные модели, даже^{в условиях регулирования}. С момента первоначального описания кишечных органоидов Сато и др. в 2009 году, технология органоидов стала чрезвычайно популярной^. Большое количество исследований очень подробно охарактеризовало клеточный состав и функции органоидных моделей 3,4,5,6. Тем не менее, световое пространство этих трехм....

Protocol

Для этого протокола требуются 3D-органоиды диаметром не менее 200 мкм, которые имеют отчетливый просвет и встраиваются в искусственный внеклеточный матрикс (ВКМ, например, Матригель). Ткани желудка человека для получения органоидов были получены с одобрения Институционального наблюдате.......

Discussion

Ограниченный доступ к просветному пространству органоидов сильно ограничил наше понимание физиологической динамики этого микроокружения. Надежный инструмент для функционального анализа люминальной физиологии расширит наши возможности по использованию органоидов в качестве модел.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets