זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

Summary

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

Abstract

הזיהוי והאפיון של תאי T ספציפיים לאנטיגן במהלך בריאות ומחלות נותר מפתח לשיפור הבנתנו את הפתופיזיולוגיה החיסונית. האתגרים הטכניים של מעקב אחר אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן ברפרטואר תאי T אנדוגניים התקדמו מאוד על ידי פיתוח ריאגנטים פפטידים:MHC טטראמרים. מולטימרים מסיסים אלה המסומנים באופן פלואורסצנטי של מולקולות MHC Class I או Class II המורכבות לאפיטופים פפטידים אנטיגניים נקשרים ישירות לתאי T בעלי ספציפיות מקבילה של קולטן תאי T (TCR) ולכן יכולים, לפיכך, לזהות אוכלוסיות תאי T ספציפיות לאנטיגן במצבן הטבעי ללא צורך בתגובה פונקציונלית המושרה על ידי ex vivo גירוי. עבור אוכלוסיות נדירות ביותר, תאי T הקשורים לטטרמר יכולים להיות מועשרים מגנטית כדי להגביר את הרגישות והאמינות של זיהוי.

ככל שהחקירה של חסינות תאי T שוכני רקמות מעמיקה, יש צורך דחוף לזהות תאי T ספציפיים לאנטיגן שעוברים אל רקמות שאינן לימפואידיות ושוכנות בהן. בפרוטוקול זה, אנו מציגים סדרה מפורטת של הוראות לבידוד ואפיון של תאי T ספציפיים לאנטיגן הנמצאים בריאות עכבר. זה כרוך בבידוד של תאי T מרקמת ריאה מעוכלת ואחריו שלב העשרה מגנטי כללי של תאי T וצביעת טטרמר לצורך ניתוח ומיון ציטומטריית זרימה. השלבים המודגשים בפרוטוקול זה משתמשים בטכניקות נפוצות ובריאגנטים זמינים, מה שהופך אותו לנגיש כמעט לכל חוקר העוסק באימונולוגיה של תאי T בעכברים, והם ניתנים להתאמה רבה למגוון ניתוחים במורד הזרם של כל אוכלוסיית תאי T ספציפיים לאנטיגן בתדר נמוך המתגוררת בריאות.

Introduction

בלב מערכת החיסון הנרכשת נמצאת היכולת של תא T לזהות אנטיגן מסוים ולהגיב לו. מתי והיכן תא T מגיב לאנטיגן הקוגנטי שלו קובע את מאזן הזיהום והאוטואימוניות, הומאוסטזיס וסרטן, בריאות ומחלות¹. מכאן נובע כי המחקר של תאי T בהקשר ספציפי של חסינות צריך להתמקד בתאים עם ספציפיות עבור אנטיגן רלוונטי של עניין. בין הפיתוחים הטכנולוגיים ששיפרו מאוד את היכולת לאפיין אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן ניתן למנות מולטימרים מסיסים (בדרך כלל טטרמרים) של מולקולות מסוג I או מדרגה II של קומפלקס היסטותאימות ראשוני (MHC) המורכבות לאפיטופים של פפטידים, הידועים יותר בשם "פפטיד MHC"2,3,4,5 ^....

Protocol

הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה מאושרים ומפותחים בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, תוכנית מוסמכת לניהול בעלי חיים של האגודה האמריקאית להסמכת טיפול בחיות מעבדה (AAALAC). ניסויים בוצעו על עכברים ונקבות זכרים ונקבות בני 8-12 שבו.......

Discussion

אפיונים קודמים של תאי T ספציפיים לאנטיגן מהריאות נהנו מהמספרים החזקים של תאי T ספציפיים לאנטיגן המתרחבים לאחר אירוע ראשוני חריף כגון חיסון תוך אפי או זיהום 20,21,22. עם זאת, אוכלוסיות נדירות יותר של תאי T בריאות, כגון תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02