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Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).
L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule T antigene-specifiche durante la salute e la malattia rimane una chiave per migliorare la nostra comprensione della fisiopatologia immunitaria. Le sfide tecniche legate al tracciamento delle popolazioni di cellule T antigene-specifiche all'interno del repertorio endogeno delle cellule T sono state notevolmente avanzate dallo sviluppo dei reagenti tetrameri peptide:MHC. Questi multimeri solubili marcati in fluorescenza di molecole MHC di classe I o II complessate con epitopi di peptidi antigenici si legano direttamente alle cellule T con corrispondente specificità del recettore delle cellule T (TCR) e possono, quindi, identificare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nel loro stato nativo senza la necessità di una risposta funzionale indotta da ex vivo stimolazione. Per popolazioni estremamente rare, le cellule T legate ai tetrameri possono essere arricchite magneticamente per aumentare la sensibilità e l'affidabilità del rilevamento.
Con l'approfondimento dello studio dell'immunità delle cellule T residenti nei tessuti, vi è un urgente bisogno di identificare le cellule T antigene-specifiche che viaggiano e risiedono nei tessuti non linfoidi. In questo protocollo, presentiamo una serie dettagliata di istruzioni per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule T antigene-specifiche presenti all'interno dei polmoni di topo. Ciò comporta l'isolamento delle cellule T dal tessuto polmonare digerito, seguito da una fase generale di arricchimento magnetico delle cellule T e dalla colorazione con tetramero per l'analisi e lo smistamento della citometria a flusso. Le fasi evidenziate in questo protocollo utilizzano tecniche comuni e reagenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile a quasi tutti i ricercatori impegnati nell'immunologia delle cellule T di topo, e sono altamente adattabili per una varietà di analisi a valle di qualsiasi popolazione di cellule T antigene-specifiche a bassa frequenza che risiedono nei polmoni.
Al centro del sistema immunitario adattativo c'è la capacità di una cellula T di riconoscere e rispondere a un antigene specifico. Quando e dove una cellula T risponde al suo antigene affine determina l'equilibrio tra infezione e autoimmunità, omeostasi e cancro, salute e malattia1. Ne consegue che lo studio delle cellule T in un contesto specifico di immunità dovrebbe concentrarsi sulle cellule con specificità per un antigene rilevante di interesse. Tra i progressi tecnologici che hanno notevolmente migliorato la capacità di caratterizzare popolazioni di cellule T antigene-specifiche vi sono multimeri solubili marcati in fluorescenza (solitame....
Le procedure descritte in questo protocollo sono approvate e sviluppate in conformità con le linee guida stabilite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Massachusetts General Hospital, un programma di gestione degli animali accreditato dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi maschi e femmine di 8-12 settimane su un background genetico C57BL/6 allevati e mantenuti nella struttura per animali MGH in specifiche co.......
La Figura 2 illustra la strategia di gating rappresentativa utilizzata nell'identificazione di rare cellule T CD4+ antigene-specifiche nei polmoni con tetrameri peptide:MHC di classe II. Lo stesso processo può essere applicato per le cellule T CD8+ antigene-specifiche con tetrameri peptide:MHC di classe I (dati non mostrati).
A causa dell'elevato numero di cellule non linfoidi nei polmoni, la rilevazione affidabile di cellule T rare antigene.......
Le precedenti caratterizzazioni delle cellule T antigene-specifiche dei polmoni hanno beneficiato del robusto numero di cellule T antigene-specifiche che si espandono a seguito di un evento di priming acuto come l'immunizzazione intranasale o l'infezione 20,21,22. Tuttavia, le popolazioni di cellule T più rare nei polmoni, come le cellule T auto-antigene-specifiche o le cellule T di memoria residenti nei tessuti, sono difficili.......
Ringraziamo L. Kuhn per l'assistenza tecnica nella lavorazione dei tessuti e nella produzione di tetrameri. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (R01 AI107020 e P01 AI165072 a J.J.M., T32 AI007512 a D.S.S.), dal Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M) e dal Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
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