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Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
A identificação e caracterização de células T específicas do antígeno durante a saúde e a doença continua sendo a chave para melhorar nossa compreensão da fisiopatologia imunológica. Os desafios técnicos de rastrear populações de células T específicas do antígeno dentro do repertório de células T endógenas foram muito avançados pelo desenvolvimento de reagentes de tetrâmero peptídeo: MHC. Esses multímeros solúveis marcados com fluorescência de moléculas MHC classe I ou classe II complexadas a epítopos de peptídeos antigênicos ligam-se diretamente às células T com especificidade correspondente do receptor de células T (TCR) e podem, portanto, identificar populações de células T específicas do antígeno em seu estado nativo sem a necessidade de uma resposta funcional induzida por ex vivo estimulação. Para populações extremamente raras, as células T ligadas ao tetrâmero podem ser enriquecidas magneticamente para aumentar a sensibilidade e a confiabilidade da detecção.
À medida que a investigação da imunidade das células T residentes no tecido se aprofunda, há uma necessidade premente de identificar células T específicas do antígeno que trafegam e residem em tecidos não linfoides. Neste protocolo, apresentamos um conjunto detalhado de instruções para o isolamento e caracterização de células T específicas do antígeno presentes nos pulmões de camundongos. Isso envolve o isolamento de células T do tecido pulmonar digerido, seguido por uma etapa geral de enriquecimento magnético de células T e coloração de tetrâmero para análise e classificação por citometria de fluxo. As etapas destacadas neste protocolo utilizam técnicas comuns e reagentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível para quase qualquer pesquisador envolvido em imunologia de células T de camundongos, e são altamente adaptáveis para uma variedade de análises a jusante de qualquer população de células T específicas de antígeno de baixa frequência que residam nos pulmões.
No coração do sistema imunológico adaptativo está a capacidade de uma célula T de reconhecer e responder a um antígeno específico. Quando e onde uma célula T responde ao seu antígeno cognato determina o equilíbrio entre infecção e autoimunidade, homeostase e câncer, saúde e doença1. Segue-se que o estudo de células T em um contexto específico de imunidade deve se concentrar nas células com especificidade para um antígeno relevante de interesse. Entre os avanços tecnológicos que aumentaram muito a capacidade de caracterizar populações de células T específicas do antígeno estão multímeros solúveis marcados com fluorescência (geralmente tetrâmeros....
Os procedimentos descritos neste protocolo são aprovados e desenvolvidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Massachusetts General Hospital, um programa de manejo de animais credenciado pela Associação Americana para o Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Os experimentos foram realizados em camundongos machos e fêmeas de 8 a 12 semanas de idade em um fundo genético C57BL / 6 criados e mantidos no biotério MGH sob co.......
A Figura 2 mostra a estratégia de gating representativa usada na identificação de células T CD4+ específicas para antígenos raros nos pulmões com tetrâmeros peptídeo:MHC classe II. O mesmo processo pode ser aplicado para células T CD8+ específicas do antígeno com tetrâmeros peptídeo:MHC classe I (dados não mostrados).
Devido ao alto número de células não linfóides nos pulmões, a detecção confiável de células T raras es.......
Caracterizações anteriores de células T específicas do antígeno dos pulmões se beneficiaram do número robusto de células T específicas do antígeno que se expandem após um evento de priming agudo, como imunização intranasal ou infecção 20,21,22. No entanto, populações de células T mais raras nos pulmões, como células T específicas do autoantígeno ou células T de memória residentes no tecido, são difíceis.......
Agradecemos a L. Kuhn pela assistência técnica no processamento de tissue e na produção de tetrâmeros. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 AI107020 e P01 AI165072 para J.J.M., T32 AI007512 para D.S.S.), o Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M) e o Comitê Executivo de Pesquisa do Hospital Geral de Massachusetts (J.J.M.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
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