Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Summary

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Abstract

A identificação e caracterização de células T específicas do antígeno durante a saúde e a doença continua sendo a chave para melhorar nossa compreensão da fisiopatologia imunológica. Os desafios técnicos de rastrear populações de células T específicas do antígeno dentro do repertório de células T endógenas foram muito avançados pelo desenvolvimento de reagentes de tetrâmero peptídeo: MHC. Esses multímeros solúveis marcados com fluorescência de moléculas MHC classe I ou classe II complexadas a epítopos de peptídeos antigênicos ligam-se diretamente às células T com especificidade correspondente do receptor de células T (TCR) e podem, portanto, identificar populações de células T específicas do antígeno em seu estado nativo sem a necessidade de uma resposta funcional induzida por ex vivo estimulação. Para populações extremamente raras, as células T ligadas ao tetrâmero podem ser enriquecidas magneticamente para aumentar a sensibilidade e a confiabilidade da detecção.

À medida que a investigação da imunidade das células T residentes no tecido se aprofunda, há uma necessidade premente de identificar células T específicas do antígeno que trafegam e residem em tecidos não linfoides. Neste protocolo, apresentamos um conjunto detalhado de instruções para o isolamento e caracterização de células T específicas do antígeno presentes nos pulmões de camundongos. Isso envolve o isolamento de células T do tecido pulmonar digerido, seguido por uma etapa geral de enriquecimento magnético de células T e coloração de tetrâmero para análise e classificação por citometria de fluxo. As etapas destacadas neste protocolo utilizam técnicas comuns e reagentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível para quase qualquer pesquisador envolvido em imunologia de células T de camundongos, e são altamente adaptáveis para uma variedade de análises a jusante de qualquer população de células T específicas de antígeno de baixa frequência que residam nos pulmões.

Introduction

No coração do sistema imunológico adaptativo está a capacidade de uma célula T de reconhecer e responder a um antígeno específico. Quando e onde uma célula T responde ao seu antígeno cognato determina o equilíbrio entre infecção e autoimunidade, homeostase e câncer, saúde e doença¹. Segue-se que o estudo de células T em um contexto específico de imunidade deve se concentrar nas células com especificidade para um antígeno relevante de interesse. Entre os avanços tecnológicos que aumentaram muito a capacidade de caracterizar populações de células T específicas do antígeno estão multímeros solúveis marcados com fluorescência (geralmente tetrâmeros....

Protocol

Os procedimentos descritos neste protocolo são aprovados e desenvolvidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Massachusetts General Hospital, um programa de manejo de animais credenciado pela Associação Americana para o Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Os experimentos foram realizados em camundongos machos e fêmeas de 8 a 12 semanas de idade em um fundo genético C57BL / 6 criados e mantidos no biotério MGH sob co.......

Discussion

Caracterizações anteriores de células T específicas do antígeno dos pulmões se beneficiaram do número robusto de células T específicas do antígeno que se expandem após um evento de priming agudo, como imunização intranasal ou infecção 20,21,22. No entanto, populações de células T mais raras nos pulmões, como células T específicas do autoantígeno ou células T de memória residentes no tecido, são difíceis.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02