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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Abstract

A identificação e caracterização de células T específicas do antígeno durante a saúde e a doença continua sendo a chave para melhorar nossa compreensão da fisiopatologia imunológica. Os desafios técnicos de rastrear populações de células T específicas do antígeno dentro do repertório de células T endógenas foram muito avançados pelo desenvolvimento de reagentes de tetrâmero peptídeo: MHC. Esses multímeros solúveis marcados com fluorescência de moléculas MHC classe I ou classe II complexadas a epítopos de peptídeos antigênicos ligam-se diretamente às células T com especificidade correspondente do receptor de células T (TCR) e podem, portanto, identificar populações de células T específicas do antígeno em seu estado nativo sem a necessidade de uma resposta funcional induzida por ex vivo estimulação. Para populações extremamente raras, as células T ligadas ao tetrâmero podem ser enriquecidas magneticamente para aumentar a sensibilidade e a confiabilidade da detecção.

À medida que a investigação da imunidade das células T residentes no tecido se aprofunda, há uma necessidade premente de identificar células T específicas do antígeno que trafegam e residem em tecidos não linfoides. Neste protocolo, apresentamos um conjunto detalhado de instruções para o isolamento e caracterização de células T específicas do antígeno presentes nos pulmões de camundongos. Isso envolve o isolamento de células T do tecido pulmonar digerido, seguido por uma etapa geral de enriquecimento magnético de células T e coloração de tetrâmero para análise e classificação por citometria de fluxo. As etapas destacadas neste protocolo utilizam técnicas comuns e reagentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível para quase qualquer pesquisador envolvido em imunologia de células T de camundongos, e são altamente adaptáveis para uma variedade de análises a jusante de qualquer população de células T específicas de antígeno de baixa frequência que residam nos pulmões.

Introduction

No coração do sistema imunológico adaptativo está a capacidade de uma célula T de reconhecer e responder a um antígeno específico. Quando e onde uma célula T responde ao seu antígeno cognato determina o equilíbrio entre infecção e autoimunidade, homeostase e câncer, saúde e doença1. Segue-se que o estudo de células T em um contexto específico de imunidade deve se concentrar nas células com especificidade para um antígeno relevante de interesse. Entre os avanços tecnológicos que aumentaram muito a capacidade de caracterizar populações de células T específicas do antígeno estão multímeros solúveis marcados com fluorescência (geralmente tetrâmeros....

Protocol

Os procedimentos descritos neste protocolo são aprovados e desenvolvidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Massachusetts General Hospital, um programa de manejo de animais credenciado pela Associação Americana para o Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Os experimentos foram realizados em camundongos machos e fêmeas de 8 a 12 semanas de idade em um fundo genético C57BL / 6 criados e mantidos no biotério MGH sob co.......

Representative Results

A Figura 2 mostra a estratégia de gating representativa usada na identificação de células T CD4+ específicas para antígenos raros nos pulmões com tetrâmeros peptídeo:MHC classe II. O mesmo processo pode ser aplicado para células T CD8+ específicas do antígeno com tetrâmeros peptídeo:MHC classe I (dados não mostrados).

Devido ao alto número de células não linfóides nos pulmões, a detecção confiável de células T raras es.......

Discussion

Caracterizações anteriores de células T específicas do antígeno dos pulmões se beneficiaram do número robusto de células T específicas do antígeno que se expandem após um evento de priming agudo, como imunização intranasal ou infecção 20,21,22. No entanto, populações de células T mais raras nos pulmões, como células T específicas do autoantígeno ou células T de memória residentes no tecido, são difíceis.......

Acknowledgements

Agradecemos a L. Kuhn pela assistência técnica no processamento de tissue e na produção de tetrâmeros. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 AI107020 e P01 AI165072 para J.J.M., T32 AI007512 para D.S.S.), o Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M) e o Comitê Executivo de Pesquisa do Hospital Geral de Massachusetts (J.J.M.).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell strainerFisher Scientific22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++Corning46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Aminoguanidine Hemisulfate SaltSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbeads, mouseMiltenyi130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)Miltenyi130-042-302Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)Miltenyi130-090-976Holds 4 LS columns
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automated tissue dissociator
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)Miltenyi130-042-401Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 medium without L-glutamineCorning15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02

References

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284....

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