Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Мы предоставляем подробный протокол для выделения и идентификации популяций редких антиген-специфических Т-клеток в легких мышей с помощью обогащения Т-клеток на основе магнитных гранул и тетрамеров комплекса пептида:главного комплекса гистосовместимости (MHC).

Abstract

Идентификация и характеристика антиген-специфических Т-клеток в период здоровья и болезни остается ключом к улучшению нашего понимания иммунной патофизиологии. Технические проблемы отслеживания антиген-специфических популяций Т-клеток в эндогенном репертуаре Т-клеток значительно усложнились благодаря разработке реагентов пептида: тетрамера MHC. Эти флуоресцентно меченные растворимые мультимеры молекул MHC класса I или II, комплексованных с антигенными пептидными эпитопами, связываются непосредственно с Т-клетками с соответствующей специфичностью рецептора Т-клеток (TCR) и, следовательно, могут идентифицировать антиген-специфические популяции Т-клеток в их нативном состоянии без необходимости функционального ответа, индуцированного ex vivo стимуляция. Для чрезвычайно редких популяций Т-клетки, связанные с тетрамером, могут быть обогащены магнитами для повышения чувствительности и надежности обнаружения.

По мере углубления исследований тканевого резидентного Т-клеточного иммунитета существует насущная потребность в идентификации антиген-специфических Т-клеток, которые перемещаются и находятся в нелимфоидных тканях. В этом протоколе мы представляем подробный набор инструкций по выделению и характеристике антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мыши. Это включает в себя выделение Т-клеток из переваренной легочной ткани с последующим этапом общего магнитного обогащения Т-клеток и окрашивание тетрамерами для анализа и сортировки проточной цитометрии. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и хорошо адаптируется для различных последующих анализов любой популяции низкочастотных антиген-специфических Т-клеток, находящихся в легких.

Introduction

В основе адаптивной иммунной системы лежит способность Т-клеток распознавать и реагировать на определенный антиген. Когда и где Т-клетка реагирует на родственный ей антиген, определяет баланс инфекции и аутоиммунитета, гомеостаза и рака, здоровья и болезни1. Из этого следует, что изучение Т-клеток в конкретном контексте иммунитета должно быть сосредоточено на клетках, специфичных к соответствующему антигену, представляющему интерес. К числу технологических достижений, которые значительно расширили возможности по освидетельствованию антиген-специфических популяций Т-клеток, относятся флуоресцентно меченые растворимые мультимеры (обычно тетрамеры....

Protocol

Процедуры, описанные в этом протоколе, одобрены и разработаны в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля, программой по содержанию животных, аккредитованной ?.......

Representative Results

На рисунке 2 показана репрезентативная стратегия гейтирования, используемая при идентификации редких антиген-специфичных CD4+ Т-клеток в легких с тетрамеров класса II пептид:МНС. Тот же процесс может быть применен к антиген-специфичным CD8+ Т-клеткам с тетрамеро.......

Discussion

Предыдущая характеристика антиген-специфических Т-клеток из легких выиграла от значительного количества антиген-специфических Т-клеток, которые расширяются после острого прайминг-события, такого как интраназальная иммунизация или инфекция 20,21,22.

Disclosures

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Acknowledgements

Мы благодарим Л. Куна за техническую помощь в обработке тканей и производстве тетрамеров. Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (R01 AI107020 и P01 AI165072 к J.J.M., T32 AI007512 к D.S.S.), Массачусетским консорциумом по готовности к патогенам (J.J.M) и Исполнительным комитетом по исследованиям Массачусетской больницы общего профиля (J.J.M.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell strainerFisher Scientific22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++Corning46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Aminoguanidine Hemisulfate SaltSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbeads, mouseMiltenyi130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)Miltenyi130-042-302Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)Miltenyi130-090-976Holds 4 LS columns
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automated tissue dissociator
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)Miltenyi130-042-401Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 medium without L-glutamineCorning15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02

References

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved