A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Мы предоставляем подробный протокол для выделения и идентификации популяций редких антиген-специфических Т-клеток в легких мышей с помощью обогащения Т-клеток на основе магнитных гранул и тетрамеров комплекса пептида:главного комплекса гистосовместимости (MHC).
Идентификация и характеристика антиген-специфических Т-клеток в период здоровья и болезни остается ключом к улучшению нашего понимания иммунной патофизиологии. Технические проблемы отслеживания антиген-специфических популяций Т-клеток в эндогенном репертуаре Т-клеток значительно усложнились благодаря разработке реагентов пептида: тетрамера MHC. Эти флуоресцентно меченные растворимые мультимеры молекул MHC класса I или II, комплексованных с антигенными пептидными эпитопами, связываются непосредственно с Т-клетками с соответствующей специфичностью рецептора Т-клеток (TCR) и, следовательно, могут идентифицировать антиген-специфические популяции Т-клеток в их нативном состоянии без необходимости функционального ответа, индуцированного ex vivo стимуляция. Для чрезвычайно редких популяций Т-клетки, связанные с тетрамером, могут быть обогащены магнитами для повышения чувствительности и надежности обнаружения.
По мере углубления исследований тканевого резидентного Т-клеточного иммунитета существует насущная потребность в идентификации антиген-специфических Т-клеток, которые перемещаются и находятся в нелимфоидных тканях. В этом протоколе мы представляем подробный набор инструкций по выделению и характеристике антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мыши. Это включает в себя выделение Т-клеток из переваренной легочной ткани с последующим этапом общего магнитного обогащения Т-клеток и окрашивание тетрамерами для анализа и сортировки проточной цитометрии. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и хорошо адаптируется для различных последующих анализов любой популяции низкочастотных антиген-специфических Т-клеток, находящихся в легких.
В основе адаптивной иммунной системы лежит способность Т-клеток распознавать и реагировать на определенный антиген. Когда и где Т-клетка реагирует на родственный ей антиген, определяет баланс инфекции и аутоиммунитета, гомеостаза и рака, здоровья и болезни1. Из этого следует, что изучение Т-клеток в конкретном контексте иммунитета должно быть сосредоточено на клетках, специфичных к соответствующему антигену, представляющему интерес. К числу технологических достижений, которые значительно расширили возможности по освидетельствованию антиген-специфических популяций Т-клеток, относятся флуоресцентно меченые растворимые мультимеры (обычно тетрамеры....
Процедуры, описанные в этом протоколе, одобрены и разработаны в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля, программой по содержанию животных, аккредитованной ?.......
На рисунке 2 показана репрезентативная стратегия гейтирования, используемая при идентификации редких антиген-специфичных CD4+ Т-клеток в легких с тетрамеров класса II пептид:МНС. Тот же процесс может быть применен к антиген-специфичным CD8+ Т-клеткам с тетрамеро.......
Предыдущая характеристика антиген-специфических Т-клеток из легких выиграла от значительного количества антиген-специфических Т-клеток, которые расширяются после острого прайминг-события, такого как интраназальная иммунизация или инфекция 20,21,22.
Мы благодарим Л. Куна за техническую помощь в обработке тканей и производстве тетрамеров. Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (R01 AI107020 и P01 AI165072 к J.J.M., T32 AI007512 к D.S.S.), Массачусетским консорциумом по готовности к патогенам (J.J.M) и Исполнительным комитетом по исследованиям Массачусетской больницы общего профиля (J.J.M.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved