利用划痕伤口迁移测定和球状体发芽测定在功能和分子水平上研究血管生成

Summary

本研究提出了二维 （2D） 划痕伤口迁移测定和三维 （3D） 球状体发芽测定，以及它们各自的下游分析方法，包括 RNA 提取和免疫细胞化学，作为研究 体外血管生成的合适测定。

Abstract

血管生成在体内的生理和病理过程中起着至关重要的作用，包括肿瘤生长或新生血管性眼病。详细了解潜在的分子机制和可靠的筛选模型对于有效靶向疾病和开发新的治疗方案至关重要。已经开发了几种 体外 检测来模拟血管生成，利用受控环境提供的机会在分子水平上阐明血管生成驱动因素并筛选治疗靶点。

本研究介绍了使用人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 在体外 研究血管生成的工作流程。我们详细介绍了利用活细胞成像系统在 2D 环境中测量内皮细胞迁移的划痕伤口迁移测定，以及在胶原蛋白基质提供的 3D 环境中评估内皮细胞发芽的球状体发芽测定。此外，我们概述了样品制备策略，以实现进一步的分子分析，例如转录组学，特别是在 3D 环境中，包括 RNA 提取和免疫细胞化学。总而言之，该框架为科学家提供了一个可靠且多功能的工具集，用于进行 体外 血管生成测定的科学研究。

Introduction

血管生成是指从预先存在的血管中形成新血管¹，是生理发育和病理状况过程中的关键过程。它对于为高度代谢活跃的组织（如视网膜² 或发育中的中枢神经系统³）以及受损组织⁴ 的愈合提供能量是必不可少的。另一方面，异常的血管生成是许多疾病的基础。实体瘤，如结直肠癌或非小细胞肺癌，通过促进血管生成来促进其生长和必要的能量供应⁵。除了癌症外，糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性等眼部新生血管疾病是发达国家失明的主要原因，也是由异常血管生长引起的 ^6,7。详细了解潜在的病理机制对于理解如何增强生理性血管生成至关重要，例如，在伤口愈合中，同时更好地控制血管增生性眼病等病理状况。

在细胞水平上，血管内皮细胞在血管生成过程中被各种信号分子激活，从而启动细胞增殖和迁移⁸。细胞随后组织成层次结构，未增殖的尖端细胞在发育中的血管分支的前缘形成丝状伪足⁸。此外，快速增殖的柄细胞跟踪尖端细胞，有助于形成新兴血管。随后，募集其他细胞类型，如周细胞或平滑肌细胞，以进....

Protocol

1. HUVEC 细胞培养

注意：在无菌工作条件（无菌工作台）下执行以下所有步骤。

1. 扩展 HUVEC
   1. 对于这两种血管生成测定，使用混合的人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 或人微血管内皮细胞 （HMVEC）。
   2. 在进行分裂之前，在未包被的 T75 培养瓶中，用内皮细胞生长培养基 （EGM） 培养细胞，直到它们达到 90% 汇合。每周更换培养基 3 次。
      注意：为了加快生.......

Discussion

在本报告中，我们提出了一系列具有功能和分子读数的技术，用于研究 体外血管生成。

迁移测定代表了一种成熟的技术，用于湿实验室工作的所有领域。我们选择了市售的活细胞成像方法，以利用适用于筛选和剂量反应实验的 96 孔格式、由 WoundMaker 工具创建的标准化和可重复的伤口大小、通过延时成像观察迁移动力学的机会长达 24 小时以及自动图像量化软件。然而.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493