חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

Summary

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

Abstract

אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בגוף, כולל צמיחת הגידול או מחלת עיניים ניאו-וסקולרית. הבנה מפורטת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים ומודלי סינון אמינים חיוניים למיקוד יעיל של מחלות ולפיתוח אפשרויות טיפוליות חדשות. מספר בדיקות במבחנה פותחו כדי למדל אנגיוגנזה, תוך ניצול ההזדמנויות שסביבה מבוקרת מספקת כדי להבהיר מניעים אנגיוגניים ברמה המולקולרית ולסנן מטרות טיפוליות.

מחקר זה מציג תהליכי עבודה לחקר אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אנו מפרטים בדיקת נדידת פצעי שריטה באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים המודדת נדידת תאי אנדותל בסביבה דו-ממדית ובדיקת הנבטת ספרואיד המעריכה הנבטת תאי אנדותל בסביבה תלת-ממדית המסופקת על ידי מטריצת קולגן. בנוסף, אנו מתווים אסטרטגיות להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוחים מולקולריים נוספים כגון תעתוק, במיוחד בסביבה התלת-ממדית, כולל מיצוי RNA וכן אימונוציטוכימיה. בסך הכל, מסגרת זו מציעה למדענים ערכת כלים אמינה ורב-תכליתית כדי להמשיך את החקירות המדעיות שלהם בבדיקות אנגיוגנזה חוץ גופית .

Introduction

אנגיוגנזה, המתייחסת להיווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים¹, היא תהליך מכריע במהלך התפתחות פיזיולוגית ומצבים פתולוגיים. זה הכרחי למתן אנרגיה לרקמות פעילות מטבולית מאוד כגון הרשתית² או מערכת העצבים המרכזית המתפתחת³ ובמהלך הריפוי של רקמה פגומה⁴. אנגיוגנזה חריגה, לעומת זאת, היא הבסיס למחלות רבות. גידולים מוצקים, כגון סרטן המעי הגס או סרטן ריאות תאים שאינם קטנים, להקל על הצמיחה שלהם ואת אספקת האנרגיה הדרושה על ידי קידום אנגיוגנזה⁵. מלבד סרטן, מחלות ניאו-וסקולריות של העין כמו רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי הקשור לגיל, המייצגות גורמים מובילים לעיוורון בע....

Protocol

1. תרבית תאי HUVEC

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

1. הרחבת HUVECs
   1. עבור שתי בדיקות אנגיוגנזה, השתמש בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) או בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (HMVECs).
   2. טפחו את התאים עד שהם מגיעים למפגש .......

Discussion

בדו"ח זה, הצגנו ספקטרום של טכניקות עם קריאות פונקציונליות ומולקולריות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

בדיקת ההגירה מייצגת טכניקה מבוססת היטב המשמשת בכל תחומי עבודת המעבדה הרטובה. בחרנו בגישת ההדמיה המסחרית של תאים חיים כדי לנצל את פורמט 96 הבארות המתאים לניסויי סינון ותגובת מ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493