A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.
אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בגוף, כולל צמיחת הגידול או מחלת עיניים ניאו-וסקולרית. הבנה מפורטת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים ומודלי סינון אמינים חיוניים למיקוד יעיל של מחלות ולפיתוח אפשרויות טיפוליות חדשות. מספר בדיקות במבחנה פותחו כדי למדל אנגיוגנזה, תוך ניצול ההזדמנויות שסביבה מבוקרת מספקת כדי להבהיר מניעים אנגיוגניים ברמה המולקולרית ולסנן מטרות טיפוליות.
מחקר זה מציג תהליכי עבודה לחקר אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אנו מפרטים בדיקת נדידת פצעי שריטה באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים המודדת נדידת תאי אנדותל בסביבה דו-ממדית ובדיקת הנבטת ספרואיד המעריכה הנבטת תאי אנדותל בסביבה תלת-ממדית המסופקת על ידי מטריצת קולגן. בנוסף, אנו מתווים אסטרטגיות להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוחים מולקולריים נוספים כגון תעתוק, במיוחד בסביבה התלת-ממדית, כולל מיצוי RNA וכן אימונוציטוכימיה. בסך הכל, מסגרת זו מציעה למדענים ערכת כלים אמינה ורב-תכליתית כדי להמשיך את החקירות המדעיות שלהם בבדיקות אנגיוגנזה חוץ גופית .
אנגיוגנזה, המתייחסת להיווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים1, היא תהליך מכריע במהלך התפתחות פיזיולוגית ומצבים פתולוגיים. זה הכרחי למתן אנרגיה לרקמות פעילות מטבולית מאוד כגון הרשתית2 או מערכת העצבים המרכזית המתפתחת3 ובמהלך הריפוי של רקמה פגומה4. אנגיוגנזה חריגה, לעומת זאת, היא הבסיס למחלות רבות. גידולים מוצקים, כגון סרטן המעי הגס או סרטן ריאות תאים שאינם קטנים, להקל על הצמיחה שלהם ואת אספקת האנרגיה הדרושה על ידי קידום אנגיוגנזה5. מלבד סרטן, מחלות ניאו-וסקולריות של העין כמו רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי הקשור לגיל, המייצגות גורמים מובילים לעיוורון בע....
1. תרבית תאי HUVEC
הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).
עבור בדיקת הנדידה, חיוני לבחון ביסודיות את התמונות שצולמו בנקודת הזמן t = 0 h כדי להבטיח שהמערכת תזהה במדויק את נוכחותה של שכבה מונו-שכבתית של תאים במבנה מלא (איור 1B). נוסף על כך, יש לאשר את הבהירות והישירות של גבול הגירוד (איור 1B). האזור נטול התאים צריך להיות ברו.......
בדו"ח זה, הצגנו ספקטרום של טכניקות עם קריאות פונקציונליות ומולקולריות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.
בדיקת ההגירה מייצגת טכניקה מבוססת היטב המשמשת בכל תחומי עבודת המעבדה הרטובה. בחרנו בגישת ההדמיה המסחרית של תאים חיים כדי לנצל את פורמט 96 הבארות המתאים לניסויי סינון ותגובת מ?.......
המחברים מודים לסופי קרוגר וגבריאלה פרינץ על תמיכתן הטכנית המצוינת. אנו מודים לסבסטיאן מאייר על פיתוח תוסף ImageJ לכימות נבטי ספרואידים ולמתקן Lighthouse Core, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), המחלקה לרפואה I, בית החולים האוניברסיטאי פרייבורג על השימוש במערכת IncuCyte. הגרפיקה נוצרה עם biorender.com. עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 to F.B], Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists and Advanced Clinician Scientists to F.B.], Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.], הקונסורציום הגרמני לסרטן [מלגת CORTEX למדענים קליניים ל-J.R....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure | PAN-Biotec | P05-01100 | HEPES |
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment | Jackson IR | 115-606-072 | |
Axio Vert. A1 | Zeiss | ||
CapturePro 2.10.0.1 | JENOTIK Optical Systems | ||
Collagen Type 1 rat tail | Corning | 354236 | |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Endothelial Cell Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM |
Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | EGM |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Serva | 11290.02 | EDTA |
Fetal bovine serum | Bio&SELL | S 0615 | FBS |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled | Lonza | C2519A | HUVEC |
IncuCyte ImageLock 96-well plates | Sartorius | 4379 | |
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
Methocel | Sigma | m-0512 | |
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS | PB-MH-100-4090-GFP | PELOBiotech | |
NaOH | Carl Roth | P031.2 | |
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol) | Sigma-Aldrich | P5282-.1MG | Phalloidin-FITC |
Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientfic | 14190-094 | PBS |
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Systems | ACBRI 181 | |
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 2260939 | |
QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | 79306 | |
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor | PeproTech | 100-20 | VEGF |
Squared petri dish | Greiner | 688102 | |
Trizol | Qiagen | 79306 | |
Trypsin | PAN-Biotec | P10-024100 | |
VEGF-R2 (monoclonal) | ThermoFisher Scientific Inc. | B.309.4 | |
WoundMaker | Sartorius | 4493 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved