Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

Abstract

אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בגוף, כולל צמיחת הגידול או מחלת עיניים ניאו-וסקולרית. הבנה מפורטת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים ומודלי סינון אמינים חיוניים למיקוד יעיל של מחלות ולפיתוח אפשרויות טיפוליות חדשות. מספר בדיקות במבחנה פותחו כדי למדל אנגיוגנזה, תוך ניצול ההזדמנויות שסביבה מבוקרת מספקת כדי להבהיר מניעים אנגיוגניים ברמה המולקולרית ולסנן מטרות טיפוליות.

מחקר זה מציג תהליכי עבודה לחקר אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אנו מפרטים בדיקת נדידת פצעי שריטה באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים המודדת נדידת תאי אנדותל בסביבה דו-ממדית ובדיקת הנבטת ספרואיד המעריכה הנבטת תאי אנדותל בסביבה תלת-ממדית המסופקת על ידי מטריצת קולגן. בנוסף, אנו מתווים אסטרטגיות להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוחים מולקולריים נוספים כגון תעתוק, במיוחד בסביבה התלת-ממדית, כולל מיצוי RNA וכן אימונוציטוכימיה. בסך הכל, מסגרת זו מציעה למדענים ערכת כלים אמינה ורב-תכליתית כדי להמשיך את החקירות המדעיות שלהם בבדיקות אנגיוגנזה חוץ גופית .

Introduction

אנגיוגנזה, המתייחסת להיווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים1, היא תהליך מכריע במהלך התפתחות פיזיולוגית ומצבים פתולוגיים. זה הכרחי למתן אנרגיה לרקמות פעילות מטבולית מאוד כגון הרשתית2 או מערכת העצבים המרכזית המתפתחת3 ובמהלך הריפוי של רקמה פגומה4. אנגיוגנזה חריגה, לעומת זאת, היא הבסיס למחלות רבות. גידולים מוצקים, כגון סרטן המעי הגס או סרטן ריאות תאים שאינם קטנים, להקל על הצמיחה שלהם ואת אספקת האנרגיה הדרושה על ידי קידום אנגיוגנזה5. מלבד סרטן, מחלות ניאו-וסקולריות של העין כמו רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי הקשור לגיל, המייצגות גורמים מובילים לעיוורון בע....

Protocol

1. תרבית תאי HUVEC

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

  1. הרחבת HUVECs
    1. עבור שתי בדיקות אנגיוגנזה, השתמש בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) או בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (HMVECs).
    2. טפחו את התאים עד שהם מגיעים למפגש .......

Representative Results

עבור בדיקת הנדידה, חיוני לבחון ביסודיות את התמונות שצולמו בנקודת הזמן t = 0 h כדי להבטיח שהמערכת תזהה במדויק את נוכחותה של שכבה מונו-שכבתית של תאים במבנה מלא (איור 1B). נוסף על כך, יש לאשר את הבהירות והישירות של גבול הגירוד (איור 1B). האזור נטול התאים צריך להיות ברו.......

Discussion

בדו"ח זה, הצגנו ספקטרום של טכניקות עם קריאות פונקציונליות ומולקולריות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

בדיקת ההגירה מייצגת טכניקה מבוססת היטב המשמשת בכל תחומי עבודת המעבדה הרטובה. בחרנו בגישת ההדמיה המסחרית של תאים חיים כדי לנצל את פורמט 96 הבארות המתאים לניסויי סינון ותגובת מ?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בפרויקט זה.

Acknowledgements

המחברים מודים לסופי קרוגר וגבריאלה פרינץ על תמיכתן הטכנית המצוינת. אנו מודים לסבסטיאן מאייר על פיתוח תוסף ImageJ לכימות נבטי ספרואידים ולמתקן Lighthouse Core, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), המחלקה לרפואה I, בית החולים האוניברסיטאי פרייבורג על השימוש במערכת IncuCyte. הגרפיקה נוצרה עם biorender.com. עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 to F.B], Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists and Advanced Clinician Scientists to F.B.], Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.], הקונסורציום הגרמני לסרטן [מלגת CORTEX למדענים קליניים ל-J.R....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäurePAN-BiotecP05-01100HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-FragmentJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tailCorning354236
Collagenase DRoche 11088858001
Endothelial Cell Basal MediumLonzaCC-3156EBM
Endothelial Cell Growth MediumLonzaCC-3162EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid Serva11290.02EDTA
Fetal bovine serumBio&SELLS 0615FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooledLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates Sartorius4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis SystemSartorius
MethocelSigmam-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Phosphate-buffered salineThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial CellsCell SystemsACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlueInvitrogen by ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth FactorPeproTech100-20VEGF
Squared petri dishGreiner688102
TrizolQiagen79306
TrypsinPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo,....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HUVEC2D3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved