Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

Summary

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Abstract

A angiogênese desempenha um papel crucial nos processos fisiológicos e patológicos do corpo, incluindo o crescimento do tumor ou a doença ocular neovascular. Uma compreensão detalhada dos mecanismos moleculares subjacentes e modelos de triagem confiáveis são essenciais para direcionar doenças de forma eficaz e desenvolver novas opções terapêuticas. Vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para modelar a angiogênese, capitalizando as oportunidades que um ambiente controlado oferece para elucidar os fatores angiogênicos em nível molecular e rastrear alvos terapêuticos.

Este estudo apresenta fluxos de trabalho para investigar a angiogênese in vitro usando células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Detalhamos um ensaio de migração de feridas por arranhões utilizando um sistema de imagem de células vivas que mede a migração de células endoteliais em um ambiente 2D e o ensaio de germinação de esferóides avaliando o brotamento de células endoteliais em um ambiente 3D fornecido por uma matriz de colágeno. Além disso, delineamos estratégias para a preparação de amostras para permitir análises moleculares adicionais, como transcriptômica, particularmente no ambiente 3D, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica. Ao todo, essa estrutura oferece aos cientistas um conjunto de ferramentas confiável e versátil para realizar suas investigações científicas em ensaios de angiogênese in vitro .

Introduction

A angiogênese, que se refere à formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes¹, é um processo crucial durante o desenvolvimento fisiológico e as condições patológicas. É indispensável para fornecer energia a tecidos altamente metabolicamente ativos, como a retina² ou o sistema nervoso central em desenvolvimento³ e durante a cicatrização de tecidos danificados⁴. A angiogênese anormal, por outro lado, é a base de inúmeras doenças. Tumores sólidos, como câncer colorretal ou câncer de pulmão de células não pequenas, facilitam seu crescimento e o suprimento ....

Protocol

1. Cultura de células HUVEC

NOTA: Execute todas as etapas a seguir em condições de trabalho estéreis (bancada de trabalho estéril).

1. Expansão de HUVECs
   1. Para ambos os ensaios de angiogênese, use células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) ou células endoteliais microvasculares humanas (HMVECs).
   2. Cultive as células até atingirem 90% de confluência em um frasco T75 não revestido com meio de crescimento de células endoteliais (EGM).......

Discussion

Neste relato, apresentamos um espectro de técnicas com leituras funcionais e moleculares para estudar a angiogênese in vitro.

O ensaio de migração representa uma técnica bem estabelecida usada em todos os campos do trabalho de laboratório úmido. Escolhemos a abordagem de imagem de células vivas disponível comercialmente para aproveitar o formato de 96 poços adequado para experimentos de triagem e dose-resposta, o tamanho padronizado e reprodutível da ferida criado pela fe.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493