Исследование ангиогенеза на функциональном и молекулярном уровнях с использованием анализа миграции царапин и анализа прорастания сфероидов

Summary

В данном исследовании представлены двумерный (2D) анализ миграции царапин раны и трехмерный (3D) анализ прорастания сфероидов, а также соответствующие методы анализа, включая экстракцию РНК и иммуноцитохимию, в качестве подходящих анализов для изучения ангиогенеза in vitro.

Abstract

Ангиогенез играет решающую роль как в физиологических, так и в патологических процессах в организме, включая рост опухоли или неоваскулярные заболевания глаз. Детальное понимание основных молекулярных механизмов и надежные модели скрининга имеют важное значение для эффективного нацеливания на заболевания и разработки новых терапевтических вариантов. Для моделирования ангиогенеза было разработано несколько тестов in vitro , использующих возможности контролируемой среды для выяснения ангиогенных факторов на молекулярном уровне и скрининга терапевтических мишеней.

В этом исследовании представлены рабочие процессы изучения ангиогенеза in vitro с использованием эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs). Мы подробно описываем анализ миграции царапин раны с использованием системы визуализации живых клеток, измеряющую миграцию эндотелиальных клеток в 2D-условиях, и анализ сфероидального прорастания, оценивающий прорастание эндотелиальных клеток в 3D-условиях, обеспечиваемых коллагеновой матрицей. Кроме того, мы описываем стратегии подготовки образцов для проведения дальнейших молекулярных анализов, таких как транскриптомика, особенно в условиях 3D, включая экстракцию РНК и иммуноцитохимию. В целом, эта система предлагает ученым надежный и универсальный набор инструментов для проведения научных исследований в области анализов ангиогенеза in vitro .

Introduction

Ангиогенез, который относится к образованию новых кровеносных сосудов из уже существующих1^, является важнейшим процессом во время физиологического развития и патологических состояний. Он незаменим для обеспечения энергией высокометаболически активных тканей, таких как сетчатка^{2 или} развивающаяся центральная нервная система³, а также во время заживления поврежденных тканей⁴. Аномальный ангиогенез, с другой стороны, является основой для многочисленных заболеваний. Солидные опухоли, такие как колоректальный рак или немелкоклеточный рак легких, способствуют их росту и необходим....

Protocol

1. Культура клеток HUVEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все следующие шаги в стерильных условиях труда (на стерильном рабочем столе).

1. Расширение HUVEC
   1. Для обоих анализов ангиогенеза используйте объединенные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) или мик.......

Discussion

В этом отчете мы представили спектр методов с функциональными и молекулярными показаниями для изучения ангиогенеза in vitro.

Миграционный анализ представляет собой хорошо зарекомендовавший себя метод, используемый во всех областях влажной лабораторной работы. Мы вы.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493