Мы представляем протоколы для оценки эффективности пути репарации двухцепочечного разрыва в клетках с использованием набора экстрахромосомных репортерных субстратов на основе люминесценции.
Репарация двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) имеет решающее значение для поддержания стабильности генома и жизнеспособности клеток. Репарация DSB (DSBR) в клетках опосредована несколькими механизмами: гомологичной рекомбинацией (HR), негомологичным соединением концов (NHEJ), микрогомологически опосредованным соединением концов (MMEJ) и одноцепочечным отжигом (SSA). Клеточные анализы необходимы для измерения эффективности и модуляции этих путей в ответ на различные стимулы.
Здесь мы представляем набор внехромосомных репортерных анализов, каждый из которых измеряет восстановление репортерного гена нанолюциферазы одним из четырех основных путей DSBR в клетках. После транзиторной трансфекции в клетки, представляющие интерес, репарация чувствительных к путям репортерных субстратов может быть измерена менее чем за 24 ч путем детектирования люминесценции нанолюциферазы (NanoLuc).
Эти надежные анализы являются количественными, чувствительными, титруемыми и поддаются высокопроизводительному формату скрининга. Эти свойства обеспечивают широкое применение в исследованиях репарации ДНК и открытии лекарств, дополняя доступный в настоящее время набор инструментов клеточного анализа DSBR.
Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой особенно токсичный класс повреждений ДНК1, из-за которых клетки развили множественные пути репарации DSB (DSBR) для восстановления этих повреждений. Четырьмя основными механизмами DSBR являются гомологичная рекомбинация (HR), негомологичное соединение концов (NHEJ), микрогомологически опосредованное соединение концов (MMEJ) и одноцепочечный отжиг (SSA)2,3. Пути DSBR способствуют поддержанию здорового развития тканей и физиологии и защищают от таких заболеваний, как рак. Кроме того, эти механизмы репарации обладают терапевтическим потенциалом для разработки низкомолекулярных модуляторов в прецизионной онкологии. Например, нацеливание на ДНК-полимеразу θ (Polθ), ключевой фермент в пути репарации MMEJ, привлекло интерес из-за ее синтетической летальности при дефиците HR при раке4.
Таким образом, понимание DSBR имеет широкое клиническое применение, и необходимы функциональные клеточные анализы, способные измерять активность всех основных путей DSBR5. Анализы должны быть пригодны как для генетических, так и для фармакологических исследований и использоваться на представляющих интерес клеточных моделях. Чтобы поддержать усилия по разработке низкомолекулярных лекарств, анализы должны быть высокочувствительными, титруемыми, иметь быстрый оборот и быть масштабируемыми до высокопроизводительных форматов, подходящих для скрининга соединений.
В целом, DSBR ранее измерялся с использованием репортерных аналитических систем на основе флуоресценции, стабильно интегрированных вгеном клетки6. Тем не менее, в то время как физиологическая рекапитуляция хромосомного DSBR является явным преимуществом, такие анализы ограничены моделью хозяина, в которую интегрирован репортер, используют трудоемкую подготовку образцов и анализ с помощью проточной цитометрии, а также имеют ограниченную пропускную способность, время выполнения, надежность и чувствительность — все это важные характеристики, необходимые для разработки лекарств.
Здесь мы описываем набор репортерных анализов DSBR, которые позволяют оценить четыре основных пути DSBR. Набор субстратов для репортерного анализа представлен на рисунке 1 и более подробно описан в недавней публикации7. Они являются внехромосомными, что позволяет им внедряться в клетки путем простой транзиторной трансфекции, а включение репортерного гена8 нанолюциферазы, который должен быть восстановлен путем взаимодействия со специфическими механизмами DSBR, порождает чувствительность, надежность и масштабируемость. В протокол включены следующие варианты субстрата репортера DSBR (рисунок 1):
Резекционно-независимый MMEJ: Этот линейный субстрат состоит из основного участка двухцепочечной ДНК (дцДНК) с выступами одноцепочечной ДНК (одноцепочечной ДНК), которые имитируют резецированные концы ДНК9. Четыре нуклеотидные микрогомологии на концах областей одноцепочечной ДНК кодируют стартовый кодон для репортерного гена. Репарация этого субстрата с помощью MMEJ восстанавливает открытую рамку считывания репортерного гена (ORF).
Резекционно-зависимый MMEJ: N-концевой экзон репортерного гена прерывается сегментом, содержащим стоп-кодон, который фланкирован 8 микрогомологиями пар оснований (.о.). Нуклеолитическая резекция конца требуется перед MMEJ-опосредованной репарацией для восстановления интактного репортерного гена.
Блант Нхей: Репортерный ген расщепляется на N- и C-концевые участки, последний из которых размещается выше промотора. DSB производится с использованием EcoRV и требует прямого лигирования (без обработки конца) NHEJ для повторного соединения обеих частей репортерного гена и восстановления репортерного ORF.
Нетупой NHEJ: DSB расположен внутри интрона и будет иметь связующие или несвязные концы в зависимости от выбора фермента рестрикции. Ремонт этого субстрата NHEJ требует лигирования, которому предшествует конечная обработка.
Длинный шаблон HR: N-концевой экзон репортерного гена прерывается сегментом ДНК, содержащим сайты рестрикции, которые заменяют 22.о. исходной последовательности репортерного гена. Для восстановления этой последовательности при репарации с помощью HR используется гомологический шаблон размером 2,5 килооснования (кб), помещенный ниже по потоку от С-концевого экзона.
Короткий шаблон HR: Сайт рестрикции, необходимый для генерации DSB, заменяет часть нативной последовательности репортерного гена и вводит стоп-кодон в кадре. Как и версия с длинным шаблоном, эта HR-подложка требует нисходящего шаблона гомологии (360.н.) для точного ремонта и восстановления ORF репортера.
SSA: Этот субстрат содержит преждевременный стоп-кодон, расположенный в N-концевом экзоне репортерного гена. Удаление этого стоп-кодона и восстановление интактной последовательности репортерного гена требует репарации с помощью SSA, которая включает в себя двунаправленную дальнюю резекцию перед выравниванием гомологий.
Для получения DSB некоторые из репортерных субстратов могут быть расщеплены с помощью I-SceI (рис. 1). Это позволит получить линейную подложку с несвязными концами в резекционно-зависимых MMEJ, нетупых NHEJ, длинных шаблонах HR и SSA, которые имеют тандемные сайты I-SceI в инвертированных ориентациях. В коротком шаблоне подложки HR-репортера усвоение одного сайта I-SceI приведет к созданию связных концов. Нетупые NHEJ, резекционно-зависимые MMEJ, длинные матрицы HR и SSA плазмиды также могут быть расщеплены с помощью HindIII, что приведет к получению комплементарных когезивных концов.
Мы предоставляем протоколы для создания субстратов репортерного анализа и описываем, как эти анализы могут быть выполнены, предоставляя подробную информацию о том, как они могут быть использованы для количественной оценки DSBR, включая титруемые ответы на малые молекулы, оценку клеточной активности, целевой активности и селективности путей.
1. Подготовка и контроль качества (КК) репортерных подложек
Примечание: Плазмиды, кодирующие репортерные субстраты, могут размножаться в стандартных штаммах Escherichia coli (например, DH5α и производные) и восстанавливаться путем выделения плазмид. Детали плазмид (размер и устойчивость к антибиотикам) описаны в таблице 1 и на рисунке 1.
Рисунок 1: Схемы внехромосомных репортерных анализов DSBR на основе NanoLuc. Схематическое изображение подложек репортеров DSBR, включая их расположение в каждой исходной плазмиде, особенности главной последовательности и окончательную компоновку после репарации, специфичной для конкретного пути. Независимое от резекции ядро субстрата MMEJ вырезают из исходной плазмиды путем разложения с помощью XhoI/HindIII, после чего колпачки должны быть перевязаны с обоих концов для получения субстрата для MMEJ. Тупой репортерный субстрат NHEJ создается путем эксцизии из исходной плазмиды с помощью EcoRV. Резекционно-зависимые MMEJ, нетупые NHEJ, длинные матричные HR и репортерные субстраты SSA генерируются путем линеаризации исходных плазмид с использованием либо I-SceI (который дает некогезивные концы), либо HindIII (который создает когезивные концы). Короткий шаблон подложки HR reporter генерируется путем линеаризации исходной плазмиды с помощью I-SceI (который создает связующие концы). Репарация каждого репортерного субстрата по целевому пути DSBR восстанавливает интактную нанолюциферазу ORF, кодирующую функционал NanoLuc. Эта цифра была адаптирована из Rajendra et al.7. Сокращения: DSBR = ремонт двухцепочечного разрыва; NanoLuc = нанолюцифераза; MMEJ = микрогомологически опосредованное соединение концов; NHEJ = негомологичное соединение концов; HR = гомологичная рекомбинация; SSA = одноцепочечный отжиг; ORF = открытая рамка для чтения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Иллюстрация 2: Гель-электрофоретический анализ генерации подложки репортера DSBR. (А-С) Репрезентативные изображения гелевых электрофоретических анализов промежуточных продуктов и окончательной конструкции, необходимой для создания независимой от резекции репортерной подложки MMEJ. Соседние изображения на панелях (А) и (С) сделаны из тех же гелей; Нерелевантные полосы были опущены. (Д,Э) Репрезентативные изображения гель-электрофоретического анализа на исходную плазмиду, продукты, расщепленные EcoRV, и конечную конструкцию, экстрагированную гелем, необходимые для создания тупой репортерной подложки NHEJ. (Ф-Дж) Репрезентативные изображения гелевых электрофоретических анализов исходных плазмид и линеаризованных конструкций DSBR для субстратов I-SceI-интерпретированных репортеров: резекционно-зависимый MMEJ, нетупой NHEJ, длинный шаблон HR, короткий шаблон HR, SSA. Сокращения: DSBR = ремонт двухцепочечного разрыва; MMEJ = микрогомологически опосредованное соединение концов; NHEJ = негомологичное соединение концов; HR = гомологичная рекомбинация; SSA = одноцепочечный отжиг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
2. Переходная трансфекция репортерных субстратов DSBR
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор экспериментального процесса анализов и некоторые потенциальные перестановки представлены на рисунке 3. В приведенном ниже протоколе описан эксперимент с использованием клеток HEK-293, в котором они подвергаются обратной трансфекции репортерным субстратом. Приведенные ниже цифры могут быть увеличены или уменьшены в зависимости от количества скважин, используемых на одной пластине. Следующие шаги рассчитаны для анализа, выполненного в одном 96-луночном планшете; дополнительные соображения см. в разделе Обсуждение.
Рисунок 3: Экспериментальный рабочий процесс для репортерных анализов DSBR. Представляющие интерес клетки трансфицируют линеаризовавшимся субстратом DSBR (кодирующим NanoLuc ORF, который необходимо репарировать с помощью определенного события репарации ДНК) и плазмидой Firefly (контроль трансфекции). Затем, через 6-24 ч после трансфекции, люминесценция Firefly и люминесценция NanoLuc могут быть последовательно считаны после добавления реагентов Nano-Glo Dual-Luciferase. Примеры перестановок основных этапов (показаны в светло-голубых рамках) могут быть использованы для проверки того, как генетическая модуляция (нокаут, нокдаун или сверхэкспрессия) или фармакологическое лечение влияют на владение DSBR-путями в клетках. Сокращения: DSBR = ремонт двухцепочечного разрыва; NanoLuc = нанолюцифераза; WT = дикий тип; KO = нокаут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
3. Обнаружение люминесценции
4. Анализ данных
Восстановление каждого из репортерных анализов может быть обнаружено и количественно определено с помощью одной и той же процедуры. Правильная репарация субстрата с помощью родственного ему пути репарации в клетках восстановит неповрежденный, функциональный ORF, кодирующий NanoLuc. Этот сигнал люминесценции может быть обнаружен с помощью считывателя пластин.
Ко-трансфекция с интактной плазмидой, кодирующей люциферазу светлячка, служит контролем трансфекции. Этот контроль служит двум целям. Во-первых, он обеспечивает стандарт для нормализации сигнала NanoLuc, поскольку он должен быть невозмущен модуляцией DSBR генетическими или фармакологическими средствами. Во-вторых, он может указывать на нецелевые клеточные возмущения, которые влияют на сигнал люциферазы, такие как модуляция клеточного цикла, влияние на транскрипцию/трансляцию или общая токсичность.
Отношение NanoLuc к Firefly служит суррогатным считыванием ремонта. Значения люминесценции могут быть экспортированы и проанализированы путем нормализации двух сигналов люциферазы из одной лунки. В случае исследований генетических возмущений (например, сравнение дикого типа и KO или нецелевых и целевых минографических миРНК) репарация обычно нормализуется по отношению к родительскому образцу (клеткам дикого типа или клеткам, обработанным нецелевыми контрольными миРНК). В случае фармакологической модуляции значения из образца, обработанного соединением, нормализуются до значения, полученного при обработке носителем.
Недавно была опубликована полная валидация описанного набора репортеров7. Данные, иллюстрирующие характеристику генетической и фармакологической модуляции DSBR, показаны на рисунке 4 (адаптировано из 7). Polθ является ключевым медиатором MMEJ, и прогнозируется, что потеря или ингибирование этого фермента приведет к специфической абляции клеточного MMEJ 3,10. Используя клеточную линию, в которой POLQ, ген, кодирующий Polθ, был нокаутирован11, независимый от резекции репортерный анализ MMEJ показывает, что MMEJ действительно почти полностью подавлен. Оценка компонентных сигналов люминесценции NanoLuc и Firefly показывает, что наблюдаемый дефект репарации обусловлен снижением сигнала NanoLuc (закодированного репортерной подложкой), в то время как сигнал Firefly (контроль) является невозмущенным (рис. 4A-C). В отличие от этого, оценка уровня владения NHEJ с использованием репортера NHEJ с тупым концом показывает, что нокаут POLQ не препятствует восстановлению субстрата репортера (рис. 4D-F). В совокупности эти генетические данные подтверждают специфическую роль Polθ в MMEJ-опосредованной репарации. Эти наблюдения полностью фармакологически повторяются с ART55812,13, недавно описанным высокомощным и специфичным ингибитором полимеразного домена Polθ (рисунок 4G), где наблюдается титруемое ингибирование MMEJ, которое происходит от специфического снижения NanoLuc, а не сигнала Firefly (рисунок 4H). Кроме того, в соответствии с генетическими данными, нет никакого влияния на NHEJ (рис. 4I, J). Вместе эти данные показывают, как эти репортеры могут быть использованы для характеристики генетической модуляции путей DSBR и демонстрации клеточной активности и специфичности малых молекул в отношении мишени/пути.
Рисунок 4: Влияние генетического нокаута и фармакологического ингибирования Polθ на репортерные сигналы MMEJ и NHEJ. Клетки eHAP1 WT и POLQ(-) трансфицировали контрольной плазмидой Firefly и независимым от резекции репортером MMEJ (A-C) или репортером NHEJ с тупым концом (D-F). Процент репарации MMEJ или NHEJ представляет собой отношение люминесценции NanoLuc к люминесценции Firefly, нормализованное к контролю, обработанному DMSO, через 24 ч после трансфекции. Данные представляют собой среднее значение ± SEM трех биологических репликатов, каждая из которых содержит в среднем 8 технических реплик. Клетки HEK-293 трансфицировали контрольной плазмидой Firefly и (G,H) независимым от резекции репортером MMEJ или репортером NHEJ с тупым концом (I,J) и обрабатывали ингибитором полимеразы Polθ ART558. Процент репарации представляет собой отношение люминесценции NanoLuc к люминесценции Firefly, нормализованное к контролю, обработанному ДМСО, через 24 ч после трансфекции. Процентное ингибирование отдельных сигналов люминесценции в пунктах (G) и (I) было рассчитано относительно контроля, обработанного ДМСО, и показано соответственно в (H) и (J). Данные представляют собой среднее значение ± SEM 2 биологических репликатов, каждая из которых имеет в среднем 4 технические репликации. Эта цифра была адаптирована из Rajendra et al.7. Сокращения: NanoLuc = нанолюцифераза; MMEJ = микрогомологически опосредованное соединение концов; NHEJ = негомологичное соединение концов; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Ингибирование сигнала репортера HR ингибитором RAD51 CAM833. (A) Клетки HEK-293 трансфицировали субстратом длинного шаблона репортера HR, контрольной плазмидой люциферазы Firefly и обрабатывали ингибитором RAD51 CAM83314. Люминесценцию NanoLuc и Firefly считывали через 16 ч после трансфекции. Процент репарации HR представляет собой отношение люминесценции NanoLuc к люминесценции Firefly, нормализованное к контролю, обработанному ДМСО. Пунктирными линиями выделено процентное ингибирование ЧСС и концентрация CAM833 на кривой EC50. Данные представляют собой среднее значение ± SEM 2 биологических репликатов, каждая из которых имеет в среднем 4 технические репликации. (В) Процентное ингибирование отдельных сигналов люминесценции в (А) рассчитывали относительно контрольной группы, обработанной ДМСО. Пунктирными линиями выделено процентное ингибирование NanoLuc и Firefly при 3,33 мкМ CAM833 (EC50). Снижение сигнала Firefly при концентрациях CAM833 ≥ 10 мкМ свидетельствует о токсичности соединений при высоких дозах; однако снижение сигнала NanoLuc наблюдается при концентрациях, где сигнал Firefly не подвержен влиянию, что позволяет предположить, что CAM833 индуцирует ингибирование ЧСС на цели. Эта цифра была адаптирована из Rajendra et al.7. Сокращения: NanoLuc = нанолюцифераза; HR = гомологичная рекомбинация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Репортерный субстрат | Исходная плазмида (размер в кб, сопротивление) | Генерация DSB | Ожидаемый размер подложки конечного репортера (кб) | |||
Резекционно-независимый MMEJ | 4.0, Кан | Резецированные 3'-хвосты путем лигирования колпачков | 1.6 | |||
Резекционно-зависимый MMEJ | 6.5, Кан | I-SceI (несвязный), HindIII (целостный) | 6.5 | |||
Блант NHEJ | 4.3, Кан | Тупые концы при иссечении из плазмиды EcoRV | 1.7 | |||
Нетупой NHEJ | 6.7, Кан | I-SceI (несвязный), HindIII (целостный) | 6.5 | |||
Длинный шаблон HR | 9.2, Кан | I-SceI (несвязный), HindIII (целостный) | 9.2 | |||
Краткий шаблон HR | 9.3, Ампер | I-SceI (целостный) | 9.3 | |||
SSA | 9.5, Кан | I-SceI (несвязный), HindIII (целостный) | 9.5 |
Таблица 1: Плазмиды репортерного субстрата. Сокращения: DSB = двухцепочечный разрыв; MMEJ = микрогомологически опосредованное соединение концов; NHEJ = негомологичное соединение концов; HR = гомологичная рекомбинация; SSA = одноцепочечный отжиг; Кан = канамицин; Амф = ампициллин.
Последовательность (5'-3') | Поставщик | Очистка | Функция | ||
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGAAGACCAT | Сигма | СТРАНИЦА | Левый колпачок, длинный олигонуклеотид | ||
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC | Сигма | СТРАНИЦА | Левый колпачок, короткий олигонуклеотид | ||
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG | Сигма | СТРАНИЦА | Правый колпачок, длинный олигонуклеотид | ||
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA | Сигма | СТРАНИЦА | Правый колпачок, короткий олигонуклеотид |
Таблица 2: Олигонуклеотиды для колпачков для получения резекционно-независимого репортерного субстрата MMEJ. Сокращения: ssDNA = одноцепочечная ДНК; dsDNA = двухцепочечная ДНК; MMEJ = микрогомологически опосредованное соединение концов; PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле. Микрогомологии выделены.
Пробирный анализ Reporter | ДНК репортерного субстрата NanoLuc (μг ДНК/1x106 клеток) | Люциферазная плазмида для контроля светлячков (μг ДНК/1x106 клеток) |
Резекционно-независимый MMEJ | 0.5 | 0.66 |
Резекционно-зависимый MMEJ | 1 | 0.66 |
Блант NHEJ | 0.5 | 0.66 |
Нетупой NHEJ | 0.5 | 0.66 |
Длинный шаблон HR | 1 | 0.66 |
Краткий шаблон HR | 2 | 0.66 |
SSA | 1 | 0.66 |
Таблица 3: Количество ДНК для транзиторной трансфекции субстратов репортеров NanoLuc и плазмиды люциферазы контроля Firefly (HEK-293, формат 96-луночных планшетов). Сокращения: MMEJ = микрогомологически опосредованное соединение концов; NHEJ = негомологичное соединение концов; HR = гомологичная рекомбинация; SSA = одноцепочечный отжиг.
В данной работе мы описали протоколы для создания и реализации набора репортеров на основе экстрахромосомной люминесценции для измерения клеточного мастерства четырех основных путей DSBR (HR, NHEJ, MMEJ и SSA)7. Репортерные субстраты могут быть введены в клетки путем транзиторной трансфекции и использованы для оценки активности DSBR с использованием чувствительного и надежного считывания люминесценции NanoLuc на основе пластин, которое восстанавливается при взаимодействии с родственными клеточными путями DSBR.
Несколько этапов генерации репортерного субстрата, трансфекции субстратов в клетки и интерпретации данных имеют решающее значение для успешного проведения этих анализов. Несмотря на то, что для создания репортерных субстратов используются стандартные методы молекулярной биологии, визуализация процесса с помощью гель-электрофореза обеспечивает высочайшее качество и чистоту субстратов до трансфекции. Поскольку эти анализы основаны на транзиторной трансфекции, применяются общие соображения для этих методов. К ним относятся оптимизация плотности посева, условий трансфекции (включая реагенты и количество ДНК), а также оценка пригодности в форматах прямой и обратной трансфекции. Эти репортерные анализы были успешно проведены с использованием ряда протоколов электропорации и липофектии, и перед проведением этих анализов следует полностью изучить возможные варианты. Следует также позаботиться о проверке компонентных сигналов NanoLuc и Firefly, а не только композитного сигнала восстановления, полученного путем нормализации сигнала NanoLuc (репортерная подложка) к сигналу Firefly (контроль). Артефакты могут возникать из-за того, что соотношение обусловлено изменениями в сигнале Firefly. Например, оценка ингибирования в режиме «доза-реакция» с использованием высокоспецифичного соединения должна подавлять сигнал NanoLuc титруемым образом, не нарушая сигнал Firefly, который должен оставаться стабильным (рис. 4G, H). Тем не менее, в тех случаях, когда сигналы Firefly возмущены, полезное влияние на репарацию все еще может быть определено путем определения окна дозы, в котором сигнал Firefly не подвержен влиянию (рис. 5).
По сравнению с наиболее часто используемыми репортерными анализами DSBR, эти репортерные анализы на основе внехромосомной люминесценции имеют некоторые явные преимущества. Поскольку пути DSBR высоко консервативны, даже если клеточный механизм различается в зависимости от модели клеток, анализы все равно могут сообщать об уровне владения DSBR и выборе пути. Это открывает возможность оценки DSBR для любой модели, представляющей интерес для пользователя, при условии, что оптимальные условия трансфекции переходных процессов будут установлены заранее.
Использование нанолюциферазы в качестве репортерного гена также имеет преимущества по сравнению с флуоресцентными вариантами, которые традиционно использовались в репортерных анализах DSBR. NanoLuc быстро созревает, а люминесценция обнаруживается с высокой чувствительностью с помощью планшетного ридера8. В сочетании со скоростью восстановления субстрата (поскольку репортерные субстраты трансфицируются в клетки с готовыми к восстановлению концами DSB), этот формат репортерного анализа DSBR идеально подходит для быстрого выполнения и количественной надежности, необходимых для скрининга малых молекул в рамках каскада промышленных разработок лекарств. Действительно, недавно мы описали реализацию независимого от резекции репортерного анализа MMEJ в каскаде открытий, используемом для идентификации низкомолекулярных ингибиторов полимеразного домена Polθ13.
Кроме того, существует гибкость в проведении репортерных анализов для решения конкретных вопросов о генетических и фармакологических нарушениях DSBR (Рисунок 3). Например, перед трансфекцией репортерных субстратов клетки могут быть трансфицированы миРНК против гена, представляющего интерес, в течение 48-72 ч. В качестве альтернативы, влияние сверхэкспрессии генов на пути DSBR можно проверить, выполнив трансфекцию плазмид за 24-48 ч до трансфекции репортерных субстратов. Что касается фармакологических исследований, то в настоящем протоколе уже описано, как использование малых молекул может быть включено в стандартный рабочий процесс, но альтернативные форматы могут включать изменения в режимах обработки соединениями, такие как предварительная инкубация или промывка.
Масштабируемость транзиторной трансфекции может также поддерживать широкомасштабные подходы к скринингу, при которых периодическая трансфекция репортерных субстратов выполняется до скрининга. Кроме того, продолжительность анализа от трансфекции до считывания также может варьироваться. Хотя стандартная продолжительность может составлять 16-24 часа, некоторые анализы могут быть прочитаны всего за 6 часов7 часов. Опасения по поводу токсичности малых молекул или миРНК, которые могут поставить под угрозу жизнеспособность клеток, также должны учитываться при определении продолжительности анализа.
Таким образом, анализы, изложенные в этом исследовании и полностью описанные в недавней публикации7 , обеспечивают быструю и надежную оценку квалификации клеточного DSBR. Они обладают высокой чувствительностью и титруемостью, что делает их пригодными как для генетических, так и для фармакологических исследований. Важно отметить, что, поскольку репортерные субстраты могут быть введены в клетки путем транзиторной трансфекции, они имеют потенциал для использования в любой интересующей нас модели трансфицируемой клетки, а не ограничиваются конкретными клеточными линиями путем стабильной интеграции, как в случае с хромосомными репортерами DSBR. Тем не менее, явным ограничением этих репортерных экстрахромосомных анализов является то, что отсутствие интеграции в геном может не полностью повторять физиологический, хроматинизированный контекст репарации ДНК и связанные с ним регуляторные сигналыи оркестровку. С этой целью внехромосомные репортерные анализы дополняют существующие методы оценки DSBR и расширяют инструментарий ресурсов, пригодных как для фундаментальных исследований, так и для разработки лекарств.
Все работы финансировались компанией Artios Pharma Ltd. Рисунок 1 и Рисунок 3 были созданы совместно с Biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved