Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

Summary

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) combina entrega consistente e de alto rendimento com alta viabilidade celular. A introdução de medições de impedância elétrica transepitelial (TEEI) fornece informações sobre os processos intermediários do PSEP e permite a entrega sem rótulos. Este artigo discute um método para realizar experimentos de entrega de PSEP e análise de medição TEEI simultaneamente.

Abstract

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) é um método emergente de eletroporação que fornece alto rendimento e entrega consistente. Como muitos outros tipos de entrega intracelular, o PSEP depende muito de marcadores fluorescentes e microscopia fluorescente para determinar o sucesso da entrega. Para obter informações sobre as etapas intermediárias do processo de eletroporação, foi desenvolvida uma plataforma PSEP com monitoramento integrado de impedância elétrica transepitelial (TEEI). As células são cultivadas em inserções disponíveis comercialmente com membranas porosas. Após um período de incubação de 12 h para permitir a formação de uma monocamada celular totalmente confluente, as inserções são colocadas em meios de transfecção localizados nos poços do dispositivo PSEP. As monocamadas celulares são então submetidas a uma forma de onda definida pelo usuário e a eficiência de entrega é confirmada por microscopia fluorescente. Esse fluxo de trabalho pode ser significativamente aprimorado com medições TEEI entre microscopia pulsante e fluorescente para coletar dados adicionais sobre o processo PSEP, e esses dados TEEI adicionais estão correlacionados com métricas de entrega, como eficiência e viabilidade de entrega. Este artigo descreve um protocolo para a realização de PSEP com medidas TEEI.

Introduction

A eletroporação é uma técnica na qual as células são expostas a um campo elétrico, criando poros temporários na membrana celular através dos quais cargas, incluindo proteínas, RNA e DNA, podem passar ^1,2. A versão mais utilizada é a eletroporação em massa (BEP). A BEP é realizada enchendo uma cubeta com um eletrólito contendo milhões de células, expondo o eletrólito a alta voltagem e permitindo que a carga entre nas células por difusão ou endocitose¹. Há muitas vantagens no BEP, incluindo alto rendimento e vários sistemas disponíveis comercialmente. No ....

Protocol

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes e cultura celular

1. Prepare o meio de cultura celular adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) e 5 mL de penicilina-estreptomicina a um recipiente de 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Produzir onze alíquotas de 50 ml para reduzir o risco de contaminação e refrigerar.......

Discussion

A Figura 2C demonstra que os aumentos de TEEI do mínimo e as diminuições da linha de base são plotados para cada tensão da forma de onda PSEP. O aumento do TEEI cria um arco parabólico, atingindo um pico de cerca de 20 volts antes de reduzir, enquanto a diminuição do TEEI da linha de base aumenta exponencialmente à medida que a tensão aumenta. A eficiência de entrega e as porcentagens de morte na Figura 2D refletem es.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046