A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Электропористая субстрата (PSEP) сочетает в себе стабильную высокую производительность с высокой жизнеспособностью ячеек. Введение измерений трансэпителиального электрического импеданса (TEEI) дает представление о промежуточных процессах PSEP и позволяет доставлять продукцию без меток. В данной статье рассматривается метод одновременного проведения экспериментов по доставке PSEP и анализа измерений TEEI.
Электропористая субстрата (PSEP) — это новый метод электропорации, который обеспечивает высокую производительность и стабильную подачу. Как и многие другие типы внутриклеточной доставки, PSEP в значительной степени полагается на флуоресцентные маркеры и флуоресцентную микроскопию для определения успешной доставки. Чтобы получить представление о промежуточных этапах процесса электропорации, была разработана платформа PSEP со встроенным мониторингом трансэпителиального электрического импеданса (TEEI). Клетки культивируются в коммерчески доступных вставках с пористыми мембранами. После 12-часового инкубационного периода для образования полностью сливающегося клеточного монослоя вкладыши помещают в трансфекционные среды, расположенные в лунках устройства PSEP. Затем монослои клеток подвергаются воздействию заданной пользователем формы сигнала, а эффективность доставки подтверждается с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот рабочий процесс может быть значительно улучшен с помощью измерений TEEI между импульсной и флуоресцентной микроскопией для сбора дополнительных данных о процессе PSEP, и эти дополнительные данные TEEI коррелируют с такими показателями доставки, как эффективность и жизнеспособность доставки. В данной статье описан протокол проведения PSEP с измерениями TEEI.
Электропорация — это метод, при котором клетки подвергаются воздействию электрического поля, создавая временные поры в клеточной мембране, через которые могут проходить грузы, включая белки, РНК и ДНК. Наиболее широко используемым вариантом является объемная электропорация (BEP). BEP выполняется путем заполнения кюветы электролитом, содержащим миллионы клеток, подвергая электролит воздействию высокого напряжения и позволяя грузу проникать в клетки посредством диффузии или эндоцитоза. У BEP есть много преимуществ, в том числе высокая пропускная способнос....
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка реагентов и клеточной культуры
Данный протокол устанавливает метод использования измерений TEEI для изучения промежуточных процессов электропорации и прогнозирования доставки, в частности, для клеточной линии A431 и груза PI. Хотя модификация этого протокола обсуждается далее в статье, важно отметит?.......
На рисунке 2C показано, что для каждого напряжения сигнала PSEP построены графики увеличения TEEI от минимума и уменьшения от базового уровня. Увеличение TEEI создает параболическую дугу, достигающую пика около 20 вольт перед снижением, в то время как уменьше?.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мы выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), Национальных институтов общих медицинских наук NIH P20GM113126 (Центр интегрированной биомолекулярной коммуникации Небраски) и P30GM127200 (Центр наномедицины Небраски), Совместной инициативы Небраски и Поддержки биоинженерии Воелте-Кигана. Устройство было изготовлено в NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), который частично финансируется Исследовательской инициативой штата Небраска.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 339651 | |
2-Chip Disposable Hemocytometer | Bulldog Bio | DHC-N01 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | fisherbrand | FB012937 | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3099 | |
Class II Type A2 Biosafety Cabinet | Labgard | NU-543-600 | |
Custom Components | YangLab | https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | fisherbrand | 05-539-6 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5670401 | |
Fluid Aspiration System | vacuubrand | 20727403 | |
HERACELL 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
Human Plasma Fibronectin | Sigma-Aldrich | FIBRP-RO | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | 491916-0001-000 | |
Inverted Microscope | Labomed | TCM 400 | |
PBS | cytiva | SH30256.02 | |
PCR Tube 200 µL | Sarstedt | 72.737 | |
Penicillin / Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
Pipette (0.2-2 µL) | fisherbrand Elite | FBE00002 | |
Pipette (100-1000 µL) | fisherbrand Elite | FBE01000 | |
Pipette (20-200 µL) | fisherbrand Elite | FBE00200 | |
Pipette (2-20 µL) | fisherbrand Elite | FBE00020 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Reaction Tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.300 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
Thincert (24-well) | Greiner Bio-One | 662 641 | 0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET |
Tissue Culture Plate (24-well) | fisherbrand | FB012929 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154-20mL | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved