A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Электропористая субстрата (PSEP) сочетает в себе стабильную высокую производительность с высокой жизнеспособностью ячеек. Введение измерений трансэпителиального электрического импеданса (TEEI) дает представление о промежуточных процессах PSEP и позволяет доставлять продукцию без меток. В данной статье рассматривается метод одновременного проведения экспериментов по доставке PSEP и анализа измерений TEEI.
Электропористая субстрата (PSEP) — это новый метод электропорации, который обеспечивает высокую производительность и стабильную подачу. Как и многие другие типы внутриклеточной доставки, PSEP в значительной степени полагается на флуоресцентные маркеры и флуоресцентную микроскопию для определения успешной доставки. Чтобы получить представление о промежуточных этапах процесса электропорации, была разработана платформа PSEP со встроенным мониторингом трансэпителиального электрического импеданса (TEEI). Клетки культивируются в коммерчески доступных вставках с пористыми мембранами. После 12-часового инкубационного периода для образования полностью сливающегося клеточного монослоя вкладыши помещают в трансфекционные среды, расположенные в лунках устройства PSEP. Затем монослои клеток подвергаются воздействию заданной пользователем формы сигнала, а эффективность доставки подтверждается с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот рабочий процесс может быть значительно улучшен с помощью измерений TEEI между импульсной и флуоресцентной микроскопией для сбора дополнительных данных о процессе PSEP, и эти дополнительные данные TEEI коррелируют с такими показателями доставки, как эффективность и жизнеспособность доставки. В данной статье описан протокол проведения PSEP с измерениями TEEI.
Электропорация — это метод, при котором клетки подвергаются воздействию электрического поля, создавая временные поры в клеточной мембране, через которые могут проходить грузы, включая белки, РНК и ДНК. Наиболее широко используемым вариантом является объемная электропорация (BEP). BEP выполняется путем заполнения кюветы электролитом, содержащим миллионы клеток, подвергая электролит воздействию высокого напряжения и позволяя грузу проникать в клетки посредством диффузии или эндоцитоза. У BEP есть много преимуществ, в том числе высокая пропускная способнос....
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка реагентов и клеточной культуры
Данный протокол устанавливает метод использования измерений TEEI для изучения промежуточных процессов электропорации и прогнозирования доставки, в частности, для клеточной линии A431 и груза PI. Хотя модификация этого протокола обсуждается далее в статье, важно отметит?.......
На рисунке 2C показано, что для каждого напряжения сигнала PSEP построены графики увеличения TEEI от минимума и уменьшения от базового уровня. Увеличение TEEI создает параболическую дугу, достигающую пика около 20 вольт перед снижением, в то время как уменьше?.......
Мы выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), Национальных институтов общих медицинских наук NIH P20GM113126 (Центр интегрированной биомолекулярной коммуникации Небраски) и P30GM127200 (Центр наномедицины Небраски), Совместной инициативы Небраски и Поддержки биоинженерии Воелте-Кигана. Устройство было изготовлено в NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), который частично финансируется Исследовательской инициативой штата Небраска.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 339651 | |
2-Chip Disposable Hemocytometer | Bulldog Bio | DHC-N01 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | fisherbrand | FB012937 | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3099 | |
Class II Type A2 Biosafety Cabinet | Labgard | NU-543-600 | |
Custom Components | YangLab | https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | fisherbrand | 05-539-6 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5670401 | |
Fluid Aspiration System | vacuubrand | 20727403 | |
HERACELL 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
Human Plasma Fibronectin | Sigma-Aldrich | FIBRP-RO | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | 491916-0001-000 | |
Inverted Microscope | Labomed | TCM 400 | |
PBS | cytiva | SH30256.02 | |
PCR Tube 200 µL | Sarstedt | 72.737 | |
Penicillin / Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
Pipette (0.2-2 µL) | fisherbrand Elite | FBE00002 | |
Pipette (100-1000 µL) | fisherbrand Elite | FBE01000 | |
Pipette (20-200 µL) | fisherbrand Elite | FBE00200 | |
Pipette (2-20 µL) | fisherbrand Elite | FBE00020 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Reaction Tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.300 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
Thincert (24-well) | Greiner Bio-One | 662 641 | 0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET |
Tissue Culture Plate (24-well) | fisherbrand | FB012929 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154-20mL | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved