NSF Fellowship aan BKW (DGA1148900), ondersteuning van Tessera Therapeutics Inc., de Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF, contractnummers OPP1150755 en INV-041182) en de FDA onder toekenning 75F40122C00186.

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van buffers, oplosmiddel- en antioplosmiddelstromen
<ol><li>Los alle lipidecomponenten op in ethanol bij bepaalde massaconcentraties, zoals weergegeven in tabel 1, om een patisiran LNP-formulering10 te maken. Verwarm de oplossingen voor gebruik tot 37 °C met zachte sonicatie om eventuele neergeslagen vaste stoffen weer op te lossen. OPMERKING: Grotere voorraadoplossingen van enkele milliliters kunnen worden bereid en bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid een acetaatbuffervoorraadoplossing in een concentratie van 100 mM, pH 4, door 186 mg natriumacetaat en 464 mg azijnzuur te combineren in 80 ml nucleasevrij water. Pas de pH naar behoefte aan met geconcentreerd HCl of NaOH en vul het uiteindelijke volume aan tot 100 ml.</li>
	<li>Bereid een HEPES-buffervoorraadoplossing in een concentratie van 1 M, pH 7,5, door 23,82 g HEPES-zout op te lossen in 80 ml nucleasevrij water. Pas de pH naar behoefte aan met geconcentreerd HCl of NaOH en vul het uiteindelijke volume aan tot 100 ml.</li>
	<li>Verdun het betreffende nucleïnezuurpolymeer en de buffervoorraad van 100 mM acetaat met nucleasevrij water om een RNA-oplossing van 300 μg/ml te produceren in een buffer van 30 mM-acetaat. Bereid een voldoende hoeveelheid werkoplossing voor de ontworpen experimenten voor, en dit protocol vereist in totaal 1500 μL voor zowel de CIJ- als de MIVM-mixers. OPMERKING: RNA verkregen van de leverancier zal zich al in een geschikte buffer bevinden, meestal in een concentratie van 10 mg/ml (gist-RNA) of 1 mg/ml (luciferase-coderend mRNA, LucRNA of GFP-coderend mRNA, GFP-RNA). Gist-RNA kan worden gebruikt als een goedkoop model-RNA voor precipitaties.</li>
</ol>2. Formulering van LNP's met behulp van een tweestraals CIJ-menger
<ol><li>Voorbereiding en reiniging van apparatuur<ol><li>Reinig CIJ-mixers direct voor gebruik door de mixer te spoelen met ethanol. Vul twee spuiten van 5 ml met ethanol en sluit ze elk af in een inlaatpoort van de CIJ. Druk de spuiten snel in en vang het afvalwater van de mixer op als afval. OPMERKING: CIJ-mixers kunnen worden geconstrueerd en gebruikt zoals eerder beschreven29. Er kunnen verschillende steunstandaards worden gebruikt om de CIJ-mixer vast te houden, waaronder een ringstandaard, een centrifugebuishouder of een erlenmeyer. De leveranciers van CIJ staan vermeld in de Materiaaltabel en het Aanvullend Dossier 1.</li>
		<li>Verwijder de ethanolspoelspuiten uit de CIJ. Deze spuiten kunnen worden opgeslagen en hergebruikt voor extra ethanolspoelingen van de CIJ.</li>
		<li>Droog de interne kanalen van CIJ door een droge stikstofstroom door de inlaatadapters te blazen. Gebruik alleen droge, gefilterde lucht die niet verontreinigd is met pompolienevel of spuitbussen als er geen stikstof beschikbaar is.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van oplosmiddel- en anti-oplosmiddelstromen<ol><li>Meng de lipidevoorraadoplossingen en verdun met extra ethanol tot 500 μl van de 6 mg/ml lipideoplossing vermeld in tabel 1 in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. OPMERKING: Deze formulering is de veelgebruikte Onpattro-samenstelling die 50 mol MC3, 10 mol DSPC, 38,5 mol cholesterol en 1,5 mol DMG-PEG2000 bevat.</li>
		<li>Verdun de buffervoorraad van 100 mM pH 4-acetaat tot 10 mM in een totaal volume van 4 ml als het effluentblusbad van de CIJ-mixer. NOTITIE: Er kan ook een magnetische roerstaaf aan het blusbad worden toegevoegd.</li>
		<li>Zuig 500 μl RNA-oplossing bereid in stap 1.4 op in een spuit van 1 ml. Keer de spuit om en verwijder alle lucht uit deze waterige anti-oplosmiddelstroom die nucleïnezuurpolymeer bevat.</li>
		<li>Zuig 500 μl van de in stap 2.2.1 bereide lipidenoplossing op in een spuit van 1 ml. Keer de spuit om en verdrijf alle lucht uit deze ethanolische oplosmiddelstroom die lipiden bevat.</li>
	</ol></li>
	<li>LNP-productie in een CIJ-menger<ol><li>Plaats de schone CIJ-mixer over de flacon in het blusbad. NOTITIE: Een ringstandaardklem of buizenrek vormt een handige ondersteuning voor de CIJ-mixer. Zie afbeelding 1A voor een typische CIJ-opstelling.</li>
		<li>Koppel de twee in stap 2.2.3 en stap 2.2.4 ingevulde spuiten aan op de inlaatpoorten van de CIJ-mixer.</li>
		<li>Druk beide spuiten snel in om de oplosmiddel- en antioplosmiddelstromen te mengen en verzamel lipide NP's in het blusbad. OPMERKING: de spuiten moeten snel (in minder dan 1 s) maar soepel en gelijkmatig worden ingeschoven. Asymmetrische stroming of langzame stroming zal polydisperse, grote LNP's produceren.</li>
		<li>Haal de CIJ-mixer van boven het blusbad met de spuiten er nog aan. OPMERKING: Verwijder de spuiten niet en laat het hold-up volume niet in het blusbad stromen, aangezien dit materiaal slecht gemengd is en een negatieve invloed zal hebben op de productiedispersie-eigenschappen als het in het blusbad wordt gemengd.</li>
		<li>Houd het CJ boven een afvalcontainer en verwijder de spuiten, zodat het resterende hold-up volume in de afvalcontainer kan stromen. Gooi deze spuiten weg en herhaal het reinigingsproces zoals beschreven in rubriek 2.1.</li>
		<li>Analyseer LNP's die zijn geproduceerd met de CIJ zoals beschreven in sectie 5 hieronder.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Formulering van LNP's met behulp van een MIVM-mixer met vier stralen
<ol><li>Assemblage van een MIVM-mixer, aangeduid als een micro-size MIVM (μMIVM) om deze te onderscheiden van grotere modellen die worden gebruikt voor opgeschaalde productie<ol><li>Verzamel alle afzonderlijke componenten die nodig zijn om een MIVM-mixer in elkaar te zetten: de onderste ontvanger, de menggeometrieschijf, de bovenste schijf, de O-ring en de moersleutel. OPMERKING: De constructie, assemblage en werking van MIVM zijn eerder aangetoond voor het inkapselen van hydrofobe soorten, en de leveranciers worden vermeld in aanvullend dossier 1 en de materiaaltabel29. Zie afbeelding 2 voor een schema van componenten en terminologie van de mixerstandaard.</li>
		<li>Plaats de O-ring in de groef in de mengschijf.</li>
		<li>Lijn de gaten van de mengschijf uit met de pinnen op de bovenste schijf en duw ze tegen elkaar aan zonder de O-ring los te maken.</li>
		<li>Schroef de gekoppelde mengschijf, de O-ring en de bovenste schijf losjes in de onderste ontvanger. NOTITIE: Verwijder vóór deze stap de uitlaatslang van de onderste ontvanger.</li>
		<li>Draai de bovenste schijf vast in de onderste ontvanger met behulp van de moersleutel. OPMERKING: Een anti-vastloopmiddel van voedings- of farmaceutische kwaliteit kan op de schroefdraad van de bovenste schijf worden aangebracht als draadvreten wordt waargenomen.</li>
		<li>Plaats de fitting van de uitlaatslang in de onderste ontvanger en draai deze vast om de MIVM te voltooien.</li>
		<li>Monteer de gemonteerde MIVM in de mixerstandaard zodat de uitlaatslang door de steunplaat naar buiten komt. NOTITIE: De procedure voor het afstellen van de MIVM-mixerstandaard moet periodiek worden uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de mechanische stops op de mixerstandaard correct zijn geconfigureerd29.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van oplosmiddel- en anti-oplosmiddelstromen<ol><li>Meng de twee oplossingen van de ethanolische lipideoplosmiddelstroom in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, zoals aangegeven in tabel 2, door de lipidevoorraadoplossingen te verdunnen en indien nodig extra ethanol toe te voegen om een uiteindelijke lipideconcentratie van 6 mg/ml te bereiken. OPMERKING: Dit is dezelfde samenstelling van de lipideoplossing als in 2.2.1, maar met een totaal volume van 1000 μL.</li>
		<li>Verdun de buffervoorraad van 100 mM pH 4-acetaat tot 10 mM in een totaal volume van 8 ml als het MIVM-effluentblusbad. NOTITIE: Er kan ook een magnetische roerstaaf aan het blusbad worden toegevoegd.</li>
	</ol></li>
	<li>Formulering van LNP's met behulp van een MIVM-mixer<ol><li>Plaats het blusbad van 8 ml onder de mixerstandaard zodat de uitstroomslang in het blusbad wordt geleegd.</li>
		<li>Zuig de oplosmiddel- en antioplosmiddelstromen op in gasdichte spuiten van 1 ml met behulp van een naald met stompe punt. Verwijder alle luchtbellen en gooi de naald weg. Vul elke spuit door de lucht om te keren en uit de spuit te verdrijven.</li>
		<li>Monteer de vier spuiten met de klok mee op de mixer (spuiten 1-4, tabel 2) met dezelfde stromen aan de andere kanten. Zie figuur 1B voor het uiteindelijke verschijningsschema.</li>
		<li>Houd het lagerhuis aan beide zijden van de mobiele plaat vast. Plaats de vingers niet op de onderkant van de behuizing, omdat dit knelgevaar oplevert vanwege de mechanische stops. Laat de mobiele plaat voorzichtig zakken totdat deze gelijkmatig op de spuiten rust. OPMERKING: De zuigers van de spuit moeten zich vóór gebruik allemaal op dezelfde hoogte bevinden.</li>
		<li>Druk de plaat gestaag en soepel in, met als doel de bewerking in ongeveer 0.5 s tot 1 s te voltooien voor deze stroomvolumes.</li>
		<li>Sluit het blusbad af, dat de LNP-dispersie bevat.</li>
		<li>Voer de reiniging van de MIVM na gebruik uit volgens de instructies in stap 3.5 hieronder.</li>
	</ol></li>
	<li>Formulering van LNP's met behulp van een MIVM-mixer aangedreven door een spuitpomp<ol><li>Monteer de MIVM zoals beschreven in stap 3.1.</li>
		<li>Bereid de oplosmiddel- en antioplosmiddeloplossingen in de gewenste samenstelling en in een voldoende volume voor de vereiste formuleringsgrootte (tabel 3). OPMERKING: Dit zijn dezelfde samenstellingen als de waterige antioplosmiddelen (stap 1.4) en ethanolische oplosmiddelen (stap 3.2.1), maar ze zijn opgeschaald voor gebruik met de grotere spuitvolumes in tabel 3.</li>
		<li>Laad de oplossingen in gasdichte spuiten met een volume van 20 ml en bevestig de PTFE-slang met een luer-adapter aan het uiteinde. Bereid de spuiten en slangen voor door de spuit en slang om te keren en vervolgens alle lucht te verdrijven.</li>
		<li>Monteer de spuiten in een spuitpomp en bevestig de spuiten aan de mixerinlaten op de MIVM, zoals weergegeven in afbeelding 3A. OPMERKING: Het CIJ-bestand kan op dezelfde manier ook via pompen worden bediend, maar met slechts één spuit met antioplosmiddel en oplosmiddelstroom.</li>
		<li>Verdun de buffervoorraad van 100 mM pH 4-acetaat tot 10 mM in een totaal volume van 320 ml als het MIVM-effluentblusbad.</li>
		<li>Plaats het blusbad onder de MIVM-uitlaat.</li>
		<li>Stel het volumedebiet op de spuitpomp in op 20 ml/min. OPMERKING: De volumetrische stroomsnelheden kunnen worden gevarieerd van 2 ml/min tot 40 ml/min door de waarden op de spuitpomp handmatig in te stellen om LNP's te vormen met verschillende micromengomstandigheden.</li>
		<li>Start de spuitpomp, maar laat de eerste 10 s van het afvalwater in een afvalbeker stromen. Vang het MIVM-effluent op in het blusbad na deze opstartperiode van 10 s.</li>
		<li>Verwijder het blusbad met LNP-dispersie en sluit het af met het geselecteerde (20 ml/min) volumedebiet. OPMERKING: Deze procedure kan worden herhaald om LNP's met verschillende stroomsnelheden te synthetiseren door de juiste blusbadvolumes te selecteren.</li>
		<li>Reinig de MIVM tussen elk experiment (bij het wijzigen van het debiet) door ten minste twee keer het volume van de uitlaatslang weg te spoelen om te voorkomen dat LNP's worden verzameld in de vorige stroomsnelheidstoestand voordat met de volgende LNP-synthese wordt begonnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Reiniging van apparatuur na gebruik<ol><li>Maak de mixer los van de standaard terwijl u de spuiten bevestigd houdt en houd hem boven een afvalcontainer. Verwijder de spuiten en laat het hold-up volume in de container lopen. Houd vervolgens de mixereenheid ondersteboven en gebruik de moersleutel om de mixer te demonteren.</li>
		<li>Spoel de afvoerslang af met oplosmiddel (bijv. ethanol) en droog deze af met lucht of stikstof.</li>
		<li>Spoel de menggeometrie af met een geschikt oplosmiddel, zoals gedeïoniseerd water of ethanol, gevolgd door een spoeling met ethanol. Droog de componenten met behulp van een luchtstroom of stikstof.</li>
		<li>Spoel de O-ring af met gedeïoniseerd water en dep droog. NOTITIE: Als de O-ring er uitgerekt of vervormd uitziet, laat hem dan een nacht aan de lucht drogen voordat u hem gebruikt. Houd een grote voorraad O-ringen aan, aangezien het verbruiksartikelen zijn. Als de vorm de volgende dag niet hersteld is, gooi dan de O-ring weg.</li>
		<li>Spoel de bovenste schijf grondig af met oplosmiddel en gebruik een lucht- of stikstofstroom om het oppervlak en de fittingen van de spuit te drogen.</li>
		<li>Spoel elke spuit af met een goed oplosmiddel (bijv. gedeïoniseerd water of ethanol). Breng een laatste spoeling met ethanol aan en laat aan de lucht drogen voor het volgende gebruik.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nabewerking van LNP's
<ol><li>Bufferuitwisseling en verwijdering van ethanol<ol><li>Dialyse de LNP-dispersie tegen een 10 mM HEPES-buffer bij pH 7.4 met behulp van een dialysecassette van de juiste grootte met een dialysepatroon met een molecuulgewicht van 20 kDa. OPMERKING: Deze stap verwijdert zowel de resterende 10% ethanol als verhoogt de dispersie-pH door de acetaatbuffer te vervangen door HEPES.</li>
		<li>Verdun de voorraad 1 M HEPES-buffer tot 10 mM in een totaal volume van 1 L.</li>
		<li>Laad de LNP-dispersie met behulp van een spuit en naald in een dialysecassette van 12 ml.</li>
		<li>Dompel de dialysepatroon onder in de 1 L HEPES-buffer en roer de externe buffer magnetisch. Vervang de externe HEPES-buffer na 3 uur en verwijder de dialysepatroon na nog eens 3 uur voor een totale dialysetijd van 6 uur.</li>
		<li>Trek de gedialyseerde LNP-dispersie uit de dialysecartridge en gooi de gebruikte cartridge weg.</li>
	</ol></li>
	<li>LNP-suspensieconcentratie via ultracentrifugatie<ol><li>Pipeteer de suspensie in een centrifugaalfilter van de juiste grootte met een MWCO van 100 kDa30. NOTITIE: Centrifugaalfilters zijn verkrijgbaar in verschillende maten, meestal van 0.5 ml tot 12 ml.</li>
		<li>Centrifugeer de dispersie bij 2000 x g gedurende 10-20 minuten (bij kamertemperatuur) om de concentratie met een factor 5-20x te verhogen. NOTITIE: Controleer tijdens het centrifugeren het monster elke 5 minuten om er zeker van te zijn dat er een geschikte hoeveelheid vloeistof overblijft.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Karakterisering van LNP's
<ol><li>Hydrodynamische diametermetingen met dynamische lichtverstrooiing (DLS)<ol><li>Doseer 750 μl of 900 μl van de bereide LNP-dispersie (zonder verdunningen) in respectievelijk een plastic micro- of vierkante cuvet. OPMERKING: Kleinere volumes kunnen ook in geschikte cuvetten worden gebruikt.</li>
		<li>Stel de juiste viscositeit in voor het oplosmiddel waarin de LNP's zijn gedispergeerd (d.w.z. 1,26 cP voor een ethanolmengsel van 10 vol%.</li>
		<li>Verzamel terugverstrooid licht in een hoek van 173° bij 25 °C, gevolgd door de groottebepaling van LNP met behulp van het Stokes-Einstein-model en de eerste cumulante van de uitbreiding van de lichtverstrooiingscorrelatiereeks zoals gedefinieerd in het ISO-standaarddocument 13321:1996 E.</li>
		<li>Herhaal de metingen minstens drie keer.</li>
	</ol></li>
	<li>Zeta potentiaal metingen<ol><li>Voeg ~800 μL bereide LNP-dispersie toe aan gevouwen capillaire zeta-sizercellen. OPMERKING: Om te voorkomen dat de luchtbel in het capillaire kanaal bekneld raakt, wordt de helft van de vloeistof in de cellen gedoseerd, ondersteboven gehouden en vervolgens gedraaid.</li>
		<li>Herhaal de metingen minstens drie keer. OPMERKING: De buffergeleidbaarheid moet tussen 0,2-2 milliSiemens/cm liggen voor het beste resultaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Metingen van inkapselingsefficiëntie (EE) door in de handel verkrijgbare RNA-kwantificeringskit<ol><li>Verdun de juiste hoeveelheid van de 20x Tris-EDTA (TE)-buffer bij pH 7,5 die in de testkit wordt meegeleverd tot een concentratie van 1x met behulp van nucleasevrij water.</li>
		<li>Bereid een Triton X-100 oplossing op 2 gew.%.</li>
		<li>Verdun de juiste hoeveelheid LNP-dispersies in de 1x TE-buffer om een totale massaconcentratie van ongeveer 0,6 μg/ml voor RNA te verkrijgen, met een ethanolgehalte van minder dan 0,2 vol%.</li>
		<li>Bereid vergelijkbare monsters voor als in de vorige stap, maar met 0,5 gew.% Triton X-100, dat de LNP's effectief oplost, waardoor het onderscheid tussen "vrije" en totale RNA-concentraties in de afwezigheid en aanwezigheid van Triton X-100 wordt vergemakkelijkt.</li>
		<li>Bereid de juiste hoeveelheden controle-RNA-oplossingen in de concentraties van 0 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,4 μg/ml, 0,6 μg/ml, 0,8 μg/ml en 1,0 μg/ml in de 1x TE-buffer. OPMERKING: De RNA-kit moet mogelijk in eerste instantie worden verdund.</li>
		<li>Herhaal de vorige stap maar dan op 0,5 gew.% Triton X-100.</li>
		<li>Verdun de Ribogreen kleurstof (meegeleverd in de kit) 200 keer in de 1x TE buffer.</li>
		<li>Voeg de juiste hoeveelheden van de verdunde Ribogreen-kleurstof toe aan alle bereide controle-RNA- en monsteroplossingen, met of zonder Triton X-100. De kleurstof moet gelijkmatig worden verdund over zowel het controle-RNA als de monsteroplossingen met een factor twee. Bijgevolg is de totale verdunning van de kleurstof 400 keer zo groot als de oorspronkelijke concentratie in de testkit.</li>
		<li>Vortex meng de containers.</li>
		<li>Bereid een onbehandelde, ondoorzichtige plaat met 96 putjes en platte bodem voor op analyse in een plaatlezer.</li>
		<li>Doseer volumes van 100 μL monsters en RNA-controles in afzonderlijke cellen van de plaat. OPMERKING: Let op luchtbelvorming in oplossingen die Triton X-100 bevatten. Voor elk monster worden ten minste drie replicaten uitgevoerd, waarvoor ten minste 350 μl monsters nodig zijn.</li>
		<li>Registreer de fluorescentie-intensiteit met behulp van de plaatlezer bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm, met een verlichtingsduur van ongeveer 10 s per meting. Schudden is niet nodig. OPMERKING: De EE wordt bepaald op basis van <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67047/67047eq01.jpg" style="margin: auto;">, waarbij Imet Triton en Izonder Triton de gemiddelde fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigen van drie replicaten van monsters met en zonder Triton X-100, respectievelijk, en amet Triton en azonder Triton de helling van lineaire pasvormen aangeven ten opzichte van de twee gemiddelde kalibratiecurven met en zonder Triton X-100, respectievelijk31.</li>
	</ol></li>
</ol>

Synthese van lipide nanodeeltjes met behulp van CIJ- en μMIVM-mixertechnologieën

<ol>
	<li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -. S., Jadhav, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+RNA+therapeutics:+The+great+endosomal+escape.">Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape.</a> Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).</li><li>Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+lipid+nanoparticle+structure+for+messenger+RNA+delivery.">Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery.</a> Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).</li><li>Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles&#9472;from+liposomes+to+mRNA+vaccine+delivery,+a+landscape+of+research+diversity+and+advancement.">Lipid nanoparticles&#9472;from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement.</a> ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).</li><li>Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+DNA+therapeutics:+Hallmarks+of+non-viral+gene+delivery.">Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery.</a> ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).</li><li>Semple, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery.">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).</li><li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsaturated,+trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications.">Unsaturated, trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), 2209624 (2023).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>J&#252;rgens, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-scale+siRNA+and+mRNA+LNP+manufacturing+by+various+microfluidic+mixing+techniques+-+an+evaluation+of+particle+properties+and+efficiency.">Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques - an evaluation of particle properties and efficiency.</a> OpenNano. 12, 100161 (2023).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+selective+organ-targeting+(sort)+lipid+nanoparticles+(LNPs)+using+multiple+technical+methods+for+tissue-specific+mRNA+delivery.">Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery.</a> Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).</li><li>Yanez Arteta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+reprogramming+of+cellular+protein+production+through+mRNA+delivered+by+functionalized+lipid+nanoparticles.">Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).</li><li>Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+lipid+nanoparticles+for+RNA+delivery.">Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery.</a> Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing:+A+general+method+for+encapsulating+macromolecules+in+lipid+nanoparticle+systems.">Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems.</a> J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).</li><li>Prakash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+lipid+nanoparticles+for+the+delivery+of+nucleic+acids.">Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids.</a> Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197 (2022).</li><li>Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+technologies+for+lipid+nano-microsystems+from+synthesis+to+biological+application.">Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 141 (2022).</li><li>Webb, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+for+scalable+manufacturing+of+nanomedicines+from+bench+to+GMP:+A+case+study+using+protein-loaded+liposomes.">Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes.</a> Int J Pharm. 582, 119266 (2020).</li><li>Warne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+3+billion+doses+of+comirnaty+in+2021.">Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021.</a> Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).</li><li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+nanoprecipitation+of+organic+actives+and+block+copolymers+using+a+confined+impinging+jets+mixer.">Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer.</a> Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).</li><li>Hogarth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+impact+of+systematic+hydrophobic+modification+of+model+drugs+on+the+control,+stability+and+loading+of+lipid-based+nanoparticles.">Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles.</a> J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37 (2012).</li><li>D'addio, S. M., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+drug+nanoparticle+formation+by+rapid+precipitation.">Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).</li><li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+rapid+self-assembly+of+block+copolymer+nanoparticles.">Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles.</a> Phys Rev Lett. 91 (11), 118302 (2003).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li><li>Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small-scale+multi-inlet+vortex+mixer+for+scalable+nanoparticle+production+and+application+to+the+encapsulation+of+biologics+by+inverse+flash+nanoprecipitation.">Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation.</a> J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).</li><li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+processing+and+micromixing+in+confined+impinging+jets.">Chemical processing and micromixing in confined impinging jets.</a> AIChE J. 49, 2264-2282 (2003).</li><li>Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+nanoprecipitation+for+the+encapsulation+of+hydrophobic+and+hydrophilic+compounds+in+polymeric+nanoparticles.">Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles.</a> J Vis Exp. (143), e58757 (2019).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulating+and+characterizing+lipid+nanoparticles+for+gene+delivery+using+a+microfluidic+mixing+platform.">Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform.</a> J Vis Exp. 168, e62226 (2021).</li><li>Bizmark, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribogreen+fluorescent+assay+kinetics+to+measure+ribonucleic+acid+loading+into+lipid+nanoparticle+carriers.">Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers.</a> Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083 (2024).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+lipid-based+nanoparticles:+An+efficient+delivery+system+for+nucleic+acid-based+immunotherapy.">Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy.</a> Molecules. 27 (6), 1943 (2022).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion-dependent+formation+of+lipid+nanoparticles+containing+macromolecular+payloads.">Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads.</a> Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).</li><li>El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+in+vitro+and+in+vivo+efficiency+of+mRNA-lipid+nanoparticles+formulated+by+microfluidic+mixing.">Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing.</a> J Vis Exp. (191), e64810 (2023).</li><li>Scalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+delivery+of+plasmid+DNA+in+cardiomyocytes.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes.</a> Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).</li><li>Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+formulation+of+nanoparticle+therapeutics+from+laboratory+discovery+to+clinical+scale.">Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale.</a> J Transl Med. 17 (1), 200 (2019).</li><li>Kazemian, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-nanoparticle-based+delivery+of+CRISPR/cas9+genome-editing+components.">Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components.</a> Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).</li><li>Pinkerton, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. , (2014).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Synthese van LNP's die nucleïnezuurpolymeren bevatten met behulp van twee turbulente straalmixers met beperkte botsing is gepresenteerd. Wanneer ze met de juiste snelheden worden uitgevoerd, zorgen CIJ-turbulente mixers ervoor dat de tijdschaal van mengen korter is dan de LNP-assemblagetijd, waardoor homogene oververzadigingsomstandigheden worden geproduceerd voor het vormen van kleine LNP's met smalle grootteverdelingen21. Bijgevolg vertonen LNP's gemaakt met dezelfde chemie met behulp van verschillende turbulente mixergeometrieën (de 2-jet CIJ en de 4-jet MIVM-mixer) vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen en vertonen ze goede transfectie-efficiënties (Figuur 5 en Figuur 6). LNP's gemaakt met behulp van pipetteren dat een slechtere menging produceert, resulteren daarentegen in grotere en meer polydisperse LNP's (Figuur 5A) met een lagere transfectie-efficiëntie. Het is al lang bekend dat meng- en assemblagekinetiek een belangrijke rol spelen bij LNP-verwerking; Cullis et al. merkten op dat snelle convectieve-diffuse menging van ethanol en buffer leidt tot de vorming van kleine deeltjes met een smalle grootteverdeling, terwijl langzame diffuse menging leidt tot grotere deeltjes met brede grootteverdelingen9. De tijdschaal van mengen in CIJ-turbulente mengers neemt evenredig af met de inlaatstroomsnelheden van de stromen naar de menger27. Dit wordt gekwantificeerd door het dimensieloze Reynoldsgetal (Re), dat de verhouding tussen de traagheids- en viskeuze krachten meet. De turbulentie in de mengkamers van de CIJ en MIVM treedt op bij een voldoende hoge Re, zodat de turbulente vortexrek resulteert in kleine lengteschalen die een snelle menging van oplosmiddelen en anti-oplosmiddelen door diffusie produceren. De turbulente lengteschaal is afhankelijk van de Re en niet van de specifieke geometrie van het mengapparaat. Dat is de reden waarom de CIJ of de MIVM dezelfde LNP-deeltjes maakt, en waarom MIVM-mixers van verschillende groottes dezelfde NP-maten27 maken. Bij hoge Re, overeenkomend met hoge inlaatsnelheden, kunnen LNP's reproduceerbaar worden gemaakt zonder variaties van batch tot batch (figuur 3B).
Dit protocol maakt de formulering mogelijk van een verscheidenheid aan mRNA-, DNA- of siRNA-LNP's met verschillende fysisch-chemische eigenschappen met behulp van turbulente CIJ-mixers. Deze techniek biedt niet alleen veelzijdigheid in samenstelling en concentraties, maar biedt ook een duidelijk pad om formuleringen snel te zeven bij tafelverkoop (enkele milligrammen) en de leadformuleringen op te schalen naar grotere industriële batchgroottes met productiesnelheden van 5 l/min36. Dit is een grote hindernis geweest voor verschillende andere technieken, waaronder bulkmenging en microfluïdica. Bulkverwerkingstechnieken slagen er bijvoorbeeld niet in om LNP's consistent reproduceerbaar te produceren, zelfs niet op een schaal van enkele milliliters. Microfluïdische technieken zorgen voor een aanzienlijke verbetering ten opzichte van bulkmengtechnieken om de productie van uniforme en reproduceerbare LNP's mogelijk te maken; Ze liggen echter slechts in het milligrambereik29. Zoals beschreven in de inleiding, biedt parallellisatie van microfluïdische apparaten een poging om op te schalen naar productieschalen, maar elimineert het probleem van vervuiling niet, en het kan niet zo succesvol worden geschaald als mixers op basis van confined impinging jet-technologie.
Afgezien van deze voordelen zullen CIJ-mixers een belangrijke rol spelen bij de productie van LNP's van de volgende generatie die targetingmogelijkheden vertonen of genbewerking uitvoeren. De huidige LNP-formuleringen bevatten lipiden en nucleïnezuren die vergelijkbare diffusiteiten hebben, en daarom kunnen ze zelfs worden gemaakt met een enigszins slechte menging op tafelschaal. Benaderingen voor het bewerken van genen kunnen echter de inkapseling vereisen van nucleïnezuursoorten met zeer verschillende molecuulgewichten, zoals kleine gids-RNA-moleculen en grote mRNA-transcripten, om een CAS9-eiwit te coderen37. De zeer verschillende diffusietijdschalen van deze verschillende soorten maken uniforme inkapseling in stoichiometrische verhoudingen een uitdaging. Dit probleem van uniforme inkapseling wordt meer uitgesproken naarmate de mengefficiëntie slechter wordt. Evenzo kan het richten op niet-hepatische cellen de opname van sterk gebonden, langzaam diffuse stabilisatoren vereisen (zoals blokcopolymeren met een groot moleculair gewicht met gerichte liganden). Gerichte liganden zo groot als 14 kDa kunnen worden geconjugeerd om copolymeren te blokkeren voorafgaand aan de assemblage van nanodeeltjes, waardoor hun uniforme opname in NP's mogelijk wordt met behulp van CIJ-menging38. CIJ-turbulente mixers zijn nuttige hulpmiddelen voor het vervaardigen van LNP's die zijn gemaakt met componenten met verschillende diffusiteiten.
Hoewel CIJ-turbulente mixers verschillende voordelen hebben ten opzichte van andere mixers voor het formuleren van LNP's, is het belangrijk om de beperkingen op te merken die aan elke geometrie zijn verbonden. De 2-straals CIJ-menger vereist dat beide inlaatstromen (ethanol en water) een gelijk momentum hebben (binnen 10%-30%) om een uniforme turbulente micromenging in de kamer te bereiken. Het feit dat de uitgangsstroom 50:50 oplosmiddel/anti-oplosmiddel bevat, beperkt de mate van oververzadiging in de mengholte waar neerslag optreedt29. Dit nadeel wordt verholpen door de 4-straals MIVM-mixer, omdat deze vier sproeiers met ongelijke impulsen kan gebruiken om hoge oververzadigingsomstandigheden in de mengkamer te bereiken. Bovendien moeten beide mixers in de orde van milligram totale massa zijn, waardoor ze geen ideale keuze zijn voor high-throughput screening van veel verschillende LNP-formuleringen. Voor eenvoudige LNP-formuleringen kan het beste worden gescreend met microfluïdica of pipetteerstrategieën op microgramschaal en vervolgens worden overgebracht naar de confined impinging jet-technologie wanneer een paar loodformuleringen zijn geïdentificeerd. Het is ook cruciaal om rekening te houden met de dode volumes in de mixers. In de CIJ, twee straalmixers, zijn de hold-up volumes 50-100 microliter. Deze hoeveelheid materiaal moet worden afgetrokken van de hoeveelheid die in het blusbad wordt opgevangen bij het berekenen van de terugwinning uit het proces. Deze verliezen zijn onbeduidend bij gebruik op grote schaal, maar zouden goed zijn voor 10% verliezen wanneer totale volumes van 5 ml worden geproduceerd, zoals hier wordt weergegeven. De botsende jet turbulente mixers zijn een waardevol hulpmiddel voor het produceren van LNP's op GMP-schaal, zoals blijkt uit de twee door de FDA goedgekeurde COVID-19-vaccins.

Op mRNA gebaseerde therapieën hebben een groot potentieel voor de behandeling en preventie van een breed scala aan ziekten, waaronder infectieziekten, genetische aandoeningen en kankers1. In tegenstelling tot therapieën met kleine moleculen, die passief over het celmembraan kunnen diffunderen, moeten nucleïnezuren worden ingekapseld voor intracellulaire afgifte2. Inkapseling biedt zowel structuur als stabiliteit aan mRNA, waardoor hun intracellulaire afgifte via endocytotische routes wordt vergemakkelijkt en afbraak van intra- en extracellulaire componenten zoalsnucleasen wordt voorkomen. Er is een groot aantal materialen en nanodragers ontwikkeld voor de inkapseling en afgifte van mRNA, waaronder anorganische nanodeeltjes, polymeren, lipiden en lipide-achtige materialen1. Hiervan zijn LNP's naar voren gekomen als het meest prominente toedieningsplatform voor op mRNA gebaseerde therapieën4.
LNP's zijn samengesteld uit vier lipidecomponenten: ioniseerbare lipide, cholesterol, zwitterionische lipide en PEG-lipidestabilisator5. Ioniseerbare lipiden die geschikt zijn voor mRNA-afgifte vertonen een zorgvuldig evenwicht tussen de lipidehydrofobiciteit en de dissociatieconstante (pKa) van een ternaire aminegroep6. Het ioniseerbare lipide pKa heeft meestal een pH tussen 6,0 en 6,7, zoals KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) en ALC-03157. Deze pKa-beperking op het ioniseerbare lipide maakt zowel de inkapseling van nucleïnezuurpolymeren als hydrofobe lipidezouten als de intracellulaire afgifte via een "endosoomontsnappingsproces" mogelijk. LNP's komen een doelcel binnen via (verschillende) endocytoseroutes die allemaal gepaard gaan met verzuring van het endosoom van pH 7,4 tot pH ~58. Het ioniseerbare lipide pKa zorgt ervoor dat LNP's onder fysiologische omstandigheden bijna neutrale oppervlakken hebben, maar kationisch worden in een verzurend endosoom9. Deze pH-respons maakt selectieve verstoring van alleen het endosomale membraan mogelijk, de afgifte van het ingekapselde nucleïnezuurpolymeer en behoudt de levensvatbaarheid van de cel, in tegenstelling tot permanent kationische lipiden die worden gebruikt in transfectiesystemen zoals Lipofectamine. Cholesterol is een hydrofoob, interstitiële molecule in de LNP-structuur die de lipidenvloeibaarheid verbetert. Het zwitterionische lipide speelt een structurele rol en vormt een dubbellaag op het LNP-oppervlak. Het poly(ethyleenglycol)-lipide (PEG-lipide) is een colloïdale stabilisator die de LNP-stabiliteit verbetert door een polymere sterische stabilisator op het LNP-oppervlak te geven, die bestand is tegen aggregatie van LNP's. Dit stabiliseert de LNP, vooral tijdens veranderingen in de pH die de vrije basisvorm van het ioniseerbare lipide regenereren, dat zich gedraagt als een hydrofobe olie. Het Onpattro (patisiran) recept (hierna aangeduid als LNP-formulering) wordt vaak gebruikt als uitgangspunt voor LNP-formulering met ioniseerbaar lipide MC3, cholesterol, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) en PEG2000-DMG opgelost in ethanol gemengd tegen een waterige oplossing van RNA10.
Er kunnen verschillende technieken worden gebruikt om LNP's te vervaardigen die nucleïnezuurpolymeren inkapselen, waarbij de meeste gebaseerd zijn op een gemeenschappelijk thema van het snel mengen van een ethanolstroom met lipiden met een waterige stroom die het nucleïnezuur van belang (siRNA, mRNA of DNA) bevat9,11,12,13,14 . In dit opzicht bieden bulkmengprocessen zoals pipetmenging en vortexmenging een eenvoudige strategie om LNP's te vormen die het gebruik van geavanceerde instrumenten elimineert12. Bulkmenging zorgt echter niet voor een homogene verdeling van componenten, wat leidt tot een suboptimale LNP-grootteverdeling samen met een aanzienlijke variabiliteit van batch tot batch15.
Laboratoria gebruiken routinematig microfluïdische mengtechnieken om reproduceerbare LNP's te verkrijgen door een nauwkeurigere controle over de mengomstandigheden te bereiken 12,13,16. Toch resulteren de laminaire stromingscondities in microfluïdische apparaten, die inherent zijn aan de kleine lengteschalen en lage snelheden in een microfluïdische kamer, in een relatief langzame menging van oplosmiddelen en anti-oplosmiddelen17. De afmetingen van de kleine kamers beperken de doorvoer en schaalbaarheid die nodig zijn voor de GMP-productie van LNP's ernstig, maar onderzoekers hebben microfluïdische kamers geparallelliseerd om te proberen de productievolumes op te schalen15. Een geparallelliseerde microfluïdische geometrie elimineert het probleem van lipideadsorptie aan oppervlakken tijdens de verwerking van grote volumes niet, een probleem dat gewoonlijk wordt aangeduid als "vervuiling" van het mengapparaat, en er zijn problemen met de uniformiteit en stabiliteit van stromen die het opschalen van microfluïdica uitdagend maken voor productie op industriële schaal18,19. Het is niet verwonderlijk dat farmaceutische bedrijven turbulente botsende straalmixers gebruikten om COVID-19-vaccinatiemRNA-LNP's20 te produceren.
Het productieproces van RNA-geladen LNP's omvat het mengen van een waterige bufferstroom die de RNA-lading bevat met een ethanolstroom die de vier verschillende lipidecomponenten bevat. Deze formuleringen maken gebruik van een zure buffer met een pH van 4,0 of minder, die het ioniseerbare lipide oplaadt terwijl de waterige en ethanolische stromen zich vermengen. De positief geladen ioniseerbare lipiden interageren elektrostatisch met de negatief geladen RNA's en vormen een hydrofoob RNA-lipidezout. Hydrofobe lipidensoorten, waaronder het RNA-lipidezout, slaan neer in de gemengde oplosmiddelen en vormen hydrofobe kernen. Deze kernen groeien door de precipitatie van zwitterionisch lipiden en cholesterol tot ze een kritiek punt bereiken waar voldoende gepegyleerd lipide adsorbeert op het oppervlak van de LNP's, waardoor verdere groei - nucleatie en groeimechanisme wordt gestopt 21,22,23. De toevoeging van waterige buffer aan de lipideoplossing, in de mate waarin lipiden neerslaan en LNP's worden gevormd, hangt af van twee verschillende tijdschalen: de mengperiode tussen oplosmiddel en antioplosmiddel,τ-menging, en de groeiperiode van kernen, τagg. Het dimensieloze Damköhler-getal, gedefinieerd als Da = τmix/τagg, geeft de wisselwerking tussen deze tijdschalenweer 24. In gevallen van langzame menging (Da > 1) is de uiteindelijke grootte van LNP's transportgestuurd en varieert deze met de mengtijd. Omgekeerd wordt de vloeistof tijdens snel mengen (Da < 1) gefragmenteerd in strepen of lagen met Kolmogrov-lengte, waarbij LNP-vorming uitsluitend wordt bepaald door de moleculaire diffusie van elk bestanddeel, wat resulteert in een homogene kinetiek van LNP-vorming. Om het laatste scenario te bereiken, moet de lipidenconcentratie een kritische drempel overschrijden, waardoor een toestand van oververzadiging wordt gecreëerd die bevorderlijk is voor uniforme homogene nucleatie.
Geschat wordt dat τagg varieert van enkele tientallen tot enkele honderden milliseconden25. In de meest basale configuratie worden de twee stromen, de ene met ethanol met lipiden en de andere met een waterige buffer met RNA-lading, geïnjecteerd in een kamer die bekend staat als een "confined impinging jet" (CIJ) mixer. Turbulente wervels produceren oplosmiddel/anti-oplosmiddel streeplengteschalen van 1 μm binnen 1,5 ms wanneer ze met de juiste snelheden worden gebruikt. De stroomsnelheden en menggeometrie bepalen de omzetting van lineaire impuls in turbulente wervels die de stromen mengen. Dit wordt geparametriseerd door het dimensieloze getal, het Reynoldsgetal (Re), dat lineair evenredig is met de stroomsnelheden. Re wordt berekend op basis van Re = Σ (ViDi/vi), waarbij Vi de stroomsnelheid in elke stoom is, vi de kinematische viscositeit van elke stroom en Di de stroominlaatdiameter in 2-straal CIJ-apparaten26 of de kamerdiameter in 4-straal MIVM's27. Opmerking: Sommige referenties voor het CIJ gebruiken slechts een enkele straaldiameter en -snelheid om Re28 te definiëren. Re ligt in het bereik van 1-100 in een microfluïdica-apparaat, terwijl in de CIJ-apparaten een Re van 125.000 kan worden bereikt. In een CIJ-mixer botsen stromen met gelijke impuls en verspreiden hun momentum bij impact als turbulente menging, wat leidt tot efficiënte micromenging vanwege de kleine Kolmogorov-microschalen en het kleine Damköhler-getal. Een ander type mixer is de "multiple inlet vortex mixer" (MIVM), waarbij vier stromen naar een centrale kamer worden geleid. In deze opstelling zorgen continue stromen in de gesloten mengkamer voor een goed gedefinieerde mengtijdschaal. Alle vloeistofelementen passeren de hoogenergetische mengzone in beide soorten mengers. Daarentegen bevatten eenvoudige mengapparaten zoals T-splitsingen geen kamer die een mengzone biedt, wat resulteert in minder vermenging van de twee stromen omdat de inkomende stroomimpuls grotendeels wordt afgebogen in de uitlaatrichting in plaats van in turbulente vortexgeneratie. Zowel CIJ- als MIVM-mixers kunnen in batch- of continue modus worden gebruikt en bieden flexibiliteit voor LNP-productie op verschillende schalen.
Dit protocol beschrijft hoe optimale LNP-formuleringen worden gemaakt door gebruik te maken van twee confined impinging jet-technologieën: 2-jet CIJ en de 4-jet MIVM-mixers. De werking van CIJ- en MIVM-mixers is eerder aangetoond voor de bereiding van NP's met hydrofobe kernmaterialen29. Dat artikel en die video moeten worden geraadpleegd als een aanvullende bron over de vorming van NP's met deze mixers. Deze update richt zich op de vorming van NP op basis van lipiden. Het vermogen om de grootte van LNP's af te stemmen door de micromengomstandigheden te variëren, wordt gedemonstreerd. Bovendien wordt het nut van CIJ-technologieën aangetoond bij het vormen van stabiele, monodisperse LNP's met verbeterde in-vitrotransfectie-efficiëntie in HeLa-cellen in vergelijking met LNP's die zijn gemaakt met behulp van slechte pipetmenging. Verder worden de voor- en nadelen van elke CIJ-menggeometrie besproken, samen met de juiste omstandigheden die nodig zijn voor de opschaling van deze mengers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18:0 PC (DSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365P</td>
			<td>Helper lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALC-0315</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890900</td>
			<td>Ionizable lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5 moU)</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confined Impinging Jets Mixer</td>
			<td>Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lin-MC3-DMA&#160;</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-112251&#160;</td>
			<td>Ionizable lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMG-PEG 2000</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td>PEG-lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DODMA</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890899P</td>
			<td>Ionizable lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB01130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4050.X00V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex 1648 ETFE tubing <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67047/67047eq02.jpg" style="margin: auto;" />&#8221; OD 0.093&#8221; ID</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>1648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex P-678 &#188;&#8221;-28 to Luer fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex P-940 ferrule for ETFE tubing</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-604</td>
			<td>Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer stand</td>
			<td>Holland Applied Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Markwalter &#38;&#160; Prud&#39;homme for design.26 Contact Holland for Purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td>
			<td>Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (MIVM)</td>
			<td>C.E. Conover</td>
			<td>MM1.5 35.50 V75</td>
			<td>Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet ferrule - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-205</td>
			<td>Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - MIVM</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-942</td>
			<td>Combination with ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>1517</td>
			<td>Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn&#39;t protrude into mixing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - MIVM</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fit to ferrule ID.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic two-piece syringe 1 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-309</td>
			<td>Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin, Sodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R12204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vial</td>
			<td>DWK Lifesciences</td>
			<td>74504-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL</td>
			<td>SGE</td>
			<td>100MR-LL-GT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL</td>
			<td>SGE</td>
			<td>50MR-LL-GT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>32319-500G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S320-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, Sterile</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Endotoxin Free</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-325-131</td>
			<td>RNAse and DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast RNA (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM7118</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesizing lipid nanoparticles by turbulent flow in confined impinging jet mixers

Lipide nanodeeltjes (LNP's) hebben hun enorme potentieel als therapeutische toedieningsvoertuigen aangetoond, zoals blijkt uit de goedkeuring en het wereldwijde gebruik van twee COVID-19 messenger RNA (mRNA)-vaccins. Op kleine schaal worden LNP's vaak gemaakt met behulp van microfluïdica; De beperkingen van deze apparaten verhinderen echter dat ze op grote schaal worden gebruikt. De COVID-19-vaccins worden in grote hoeveelheden vervaardigd met behulp van turbulente mixers met ingesloten impinging jet (CIJ). De CIJ-technologie maakt productie op laboratoriumschaal mogelijk met het vertrouwen dat het kan worden opgeschaald naar productievolumes. De belangrijkste concepten bij CIJ-menging zijn dat de menglengte en tijdschaal worden bepaald door de turbulentie-intensiteit in de mengholte en dat de vorming van nanodeeltjes weg van wanden plaatsvindt, waardoor het probleem van afzetting op oppervlakken en vervuiling wordt geëlimineerd. Dit werk demonstreert het proces van het maken van LNP's met behulp van confined impinging jet mixer-technologie met twee geometrieën: de twee-jet CIJ en de vier-jet multi-inlet vortex mixer (MIVM). De voor- en nadelen van elke menggeometrie worden besproken. In deze geometrieën worden LNP's gevormd door snelle menging van een organische oplosmiddelstroom (meestal ethanol met de ioniseerbare lipiden, co-lipiden en stabiliserende PEG-lipiden) met een waterige anti-oplosmiddelstroom (waterige buffer die RNA of DNA bevat). De bedrijfsparameters voor de CIJ- en MIVM-mixers worden gepresenteerd om reproduceerbare LNP's te bereiden met gecontroleerde grootte, zetapotentiaal, stabiliteit en transfectie-effectiviteit. De verschillen tussen LNP's gemaakt met slechte menging (pipetteeroplossingen) in vergelijking met CIJ-menging worden ook gepresenteerd.

mRNA-based therapeutics hold great potential for the treatment and prevention of a wide range of diseases, including infectious diseases, genetic disorders, and cancers1. Unlike small-molecule therapeutics, which can passively diffuse across the cell membrane, nucleic acids must be encapsulated for intracellular delivery2. Encapsulation provides both structure and stability to mRNA, facilitating their intracellular delivery via endocytic pathways as well as preventing degradation from intra- and extra-cellular components such as nucleases3. A host of materials and nanocarriers have been developed for the encapsulation and delivery of mRNA, including inorganic nanoparticles, polymers, lipids, and lipid-like materials1. Among these, LNPs have emerged as the most prominent delivery platform for mRNA-based therapeutics4.
LNPs are composed of four lipid components: ionizable lipid, cholesterol, zwitterionic lipid, and PEG-lipid stabilizer5. Ionizable lipids suitable for mRNA delivery exhibit a careful balance between the lipid hydrophobicity and the dissociation constant (pKa) of a ternary amine group6. The ionizable lipid pKa typically has a pH between 6.0 and 6.7, such as KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA), and ALC-03157. This pKa restriction on the ionizable lipid enables both the encapsulation of nucleic acid polymers as hydrophobic lipid salts and the intracellular delivery through an &#34;endosome escape&#34; process. LNPs enter a target cell through (various) endocytosis pathways that all involve acidification of the endosome from pH 7.4 to pH ~58. The ionizable lipid pKa ensures that LNPs have nearly neutral surfaces under physiological conditions but become cationic in an acidifying endosome9. This pH response enables selective disruption of only the endosomal membrane, the release of the encapsulated nucleic acid polymer, and preserves cell viability, unlike permanently cationic lipids used in transfection systems such as Lipofectamine. Cholesterol is a hydrophobic, interstitial molecule in the LNP structure that improves lipid fluidity. The zwitterionic lipid plays a structural role and forms a bilayer on the LNP surface. The poly(ethylene glycol)-lipid (PEG-lipid) is a colloidal stabilizer that enhances the LNP stability by imparting a polymeric steric stabilizer onto the LNP surface, which resists aggregation of LNPs. This stabilizes the LNP, particularly during changes in pH that regenerate the free base form of the ionizable lipid which behaves like a hydrophobic oil. The Onpattro (patisiran) recipe (hereafter, referred to as LNP formulation) is often used as a starting point for LNP formulation with ionizable lipid MC3, cholesterol, distearoylphosphatidylcholine (DSPC), and PEG2000-DMG dissolved in ethanol mixed against an aqueous solution of RNA10.
Several techniques can be used to manufacture LNPs encapsulating nucleic acid polymers, with most of them relying on a common theme of rapidly mixing an ethanol stream containing lipids with an aqueous stream incorporating the nucleic acid of interest (siRNA, mRNA, or DNA)9,11,12,13,14. In this regard, bulk mixing processes such as pipette mixing and vortex mixing offer a simple strategy to form LNPs that eliminates the need for using sophisticated instruments12. However, bulk mixing does not provide a homogeneous distribution of components, leading to a sub-optimal LNP size distribution along with significant batch-to-batch variability15.
Laboratories routinely use microfluidic mixing techniques to obtain reproducible LNPs by achieving more precise control over mixing conditions12,13,16. Yet, the laminar flow conditions in microfluidic devices, which are inherent due to the small length scales and low velocities in a microfluidics chamber, result in comparatively slow solvent/antisolvent mixing17. The small chamber dimensions severely limit the throughput and scalability needed for GMP production of LNPs, but researchers have parallelized microfluidic chambers to attempt to scale production volumes15. A parallelized microfluidics geometry does not eliminate the problem of lipid adsorption to surfaces during large volume processing, a problem commonly referred to as &#34;fouling&#34; of the mixing device, and there are problems with uniformity and stability of flows that make microfluidics scaleup challenging for industrial-scale production18,19. It is not surprising that pharmaceutical companies used turbulent impinging jet mixers to manufacture COVID-19 vaccination mRNA-LNPs20.
The production process of RNA-loaded LNPs entails the blending of an aqueous buffer stream containing the RNA payload with an ethanol stream containing the four distinct lipid components. These formulations utilize an acidic buffer with a pH of 4.0 or less, which charges the ionizable lipid as the aqueous and ethanolic streams mix. The positively charged ionizable lipids interact electrostatically with the negatively charged RNAs, forming a hydrophobic RNA-lipid salt. Hydrophobic lipid species, including the RNA-lipid salt, precipitate in the mixed solvents and form hydrophobic nuclei. These nuclei grow through the precipitation of zwitterionic lipid and cholesterol until reaching a critical point where sufficient pegylated lipid adsorbs on the surface of the LNPs, halting further growth -nucleation and growth mechanism21,22,23. The addition of aqueous buffer to the lipid solution, to the extent where lipids precipitate and LNPs form, hinges on two distinct time scales: the solvent-antisolvent mixing period, &#964;mix, and the nuclei growth period, &#964;agg. The dimensionless Damk&#246;hler number, defined as Da = &#964;mix/&#964;agg, captures the interplay between these time scales24. In instances of slow mixing (Da &#62; 1), the final size of LNPs is transport-controlled and varies with mixing time. Conversely, during fast mixing (Da &#60; 1), the fluid is fragmented into Kolmogrov-length striations or layers, whereby LNP formation is solely governed by the molecular diffusion of each constituent, resulting in homogeneous kinetics of LNP formation. Achieving the latter scenario demands that the lipid concentration exceeds a critical threshold, establishing a state of supersaturation conducive to uniform homogeneous nucleation.
It is estimated that &#964;agg ranges from a few tens to a few hundreds of milliseconds25. In its most basic configuration, the two streams, one containing ethanol with lipids and the other containing an aqueous buffer with RNA cargo, are injected into a chamber known as a &#34;confined impinging jet&#34; (CIJ) mixer. Turbulent vortices produce solvent/antisolvent striation length scales of 1 &#181;m within 1.5 ms when operated at appropriate velocities. The stream velocities and mixing geometry determine the conversion of linear momentum into turbulent vortices that mix the streams. This is parameterized by the dimensionless number, the Reynolds number (Re), that is linearly proportional to the flow velocities. Re is computed from Re = &#931; (ViDi/vi), where Vi is the flow velocity in each steam, vi is the kinematic viscosity of each stream, and Di is the stream inlet diameter in 2-jet CIJ devices26 or the chamber diameter in 4-jet MIVMs27. Note: Some references for the CIJ use only a single jet diameter and velocity to define Re28. Re is in the range of 1-100 in a microfluidics device, whereas in the CIJ devices, Re of 125,000 can be achieved. In a CIJ mixer, streams with equal momentum collide, dissipating their momentum upon impact as turbulent mixing, which leads to efficient micromixing due to the small Kolmogorov microscales and small Damk&#246;hler number. Another type of mixer is the &#34;multiple inlet vortex mixer&#34; (MIVM), where four streams are directed into a central chamber. In this setup, continuous flows into the confined mixing chamber ensure a well-defined mixing time scale. All fluid elements pass through the high-energy mixing zone in both types of mixers. In contrast, simple mixing devices like T-junctions do not contain a chamber that provides a mixing zone, resulting in less mixing of the two streams due to the incoming stream momentum being largely deflected into the outlet direction rather than into turbulent vortex generation. Both CIJ and MIVM mixers can be operated in batch or continuous modes, offering flexibility for LNP production at various scales.
This protocol describes how optimal LNP formulations are made by employing two confined impinging jet technologies: 2-jet CIJ and the 4-jet MIVM mixers. The operation of CIJ and MIVM mixers has been previously demonstrated for the preparation of NPs with hydrophobic core materials29. That article and video should be consulted as an additional resource on the formation of NPs with these mixers. This update focuses on lipid-based NP formation. The ability to tune the size of LNPs by varying the micro-mixing conditions is demonstrated. Additionally, the utility of CIJ technologies in forming stable, monodisperse LNPs with improved in vitro transfection efficiencies in HeLa cells when compared to LNPs made using poor pipette mixing is shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each CIJ mixing geometry, along with appropriate conditions needed for the scaleup of these mixers, are discussed.

Auteur in de schijnwerpers: Verbetering van de vorming van lipide-nanodeeltjes door turbulente menging in beperkte geometrieën

Het synthetiseren van lipide nanoparticles door turbulente stroming in besloten botsende straalmixers

Our research is focused on understanding nanoparticle formation through turbulent mixing of solvent and antisolvent streams in confined geometries. Confined turbulent mixing enables reproducible production of lipid nanoparticles under continuous flow conditions, ranging from laboratory scale at hundreds of microliters to industrial scale at dozens of liters per minute. Lipid nanoparticles are typically prepared with microfluidic devices or by pipette mixing.These microfluidic devices mix ethanol solvent and aqueous antisolvent streams in these capillary-like channels. However, these small channels and low flow rates yield a low Reynolds number, which leads to laminar mixing. And pipette mixing produces LNPs by injecting the solvent stream directly into an antisolvent bath.The current methods to make lipid nanoparticles have poor scalability and reproducibility. For example, pipette mixing is inherently variable due to the unconfined manual mixing. While microfluidic devices address some of these issues, they operate at very low flow rates.And they foul due to lipid RNA deposition on the channel walls. These issues highlight the need to have reproducible techniques with high throughput at laboratory to clinical scales. This protocol demonstrates reproducible and scalable production of lipid nanoparticles through turbulent mixing across different batch sizes.Researchers can confidently perform LNP formulation screening or optimization at small scales before producing larger batches of materials for extended trials. Turbulent mixing ensures consistent nanoparticles regardless of the batch size. Confined to geometry turbulent mixers address the major issues with existing lipid nanoparticle production techniques.Using turbulent conditions produces faster molecular scale mixing, which enables the incorporation of differently sized oligonucleotides into the LNP core. The CIJ mixer also eliminates the fouling caused by lipid deposition on the mixer walls. Turbulent flows at the same Reynolds number, have self-similar turbulent Kolmogorov scale vortices for consistent mixing.

Een gedetailleerd protocol voor het synthetiseren van lipide nanodeeltjes (LNP's) met behulp van CIJ-mixertechnologieën (Confined Impinging Jet), waaronder een CIJ met twee stralen en een vortexmixer met vier stralen met meerdere inlaten (μMIVM), wordt gedemonstreerd. De CIJ-mengers genereren reproduceerbare, turbulente micromengomgevingen, wat resulteert in de productie van monodisperse LNP's.

Lipid nanoparticles (LNPs) have demonstrated their enormous potential as therapeutic delivery vehicles, as evidenced by the approval and global usage of ...

synthesizing-lipid-nanoparticles-turbulent-flow-confined-impinging

Het synthetiseren van lipide nanoparticles door turbulente stroming in besloten botsende straalmixers

Abstract