Um protocolo detalhado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) usando tecnologias de misturador de jato de impacto confinado (CIJ), incluindo um CIJ de dois jatos e um misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM), é demonstrado. Os misturadores CIJ geram ambientes de micromistura turbulentos e reprodutíveis, resultando na produção de LNPs monodispersos.
As nanopartículas lipídicas (LNPs) demonstraram seu enorme potencial como veículos terapêuticos, conforme evidenciado pela aprovação e uso global de duas vacinas de RNA mensageiro (mRNA) COVID-19. Em pequena escala, os LNPs são frequentemente feitos usando microfluídica; no entanto, as limitações desses dispositivos impedem seu uso em larga escala. As vacinas COVID-19 são fabricadas em grandes quantidades usando misturadores turbulentos de jato de impacto confinado (CIJ). A tecnologia CIJ permite a produção em escala laboratorial com a confiança de que pode ser dimensionada para volumes de produção. Os conceitos-chave na mistura CIJ são que o comprimento da mistura e a escala de tempo são determinados pela intensidade da turbulência na cavidade de mistura e que a formação de nanopartículas ocorre longe das paredes, eliminando o problema de deposição em superfícies e incrustações. Este trabalho demonstra o processo de fabricação de LNPs usando a tecnologia de misturador de jato de impacto confinado com duas geometrias: o CIJ de dois jatos e o misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (MIVM). As vantagens e desvantagens de cada geometria de mistura são discutidas. Nessas geometrias, os LNPs são formados pela mistura rápida de um fluxo de solvente orgânico (geralmente etanol contendo lipídios ionizáveis, co-lipídios e lipídios estabilizadores de PEG) com um fluxo aquoso anti-solvente (tampão aquoso contendo RNA ou DNA). Os parâmetros operacionais para os misturadores CIJ e MIVM são apresentados para preparar LNPs reprodutíveis com tamanho controlado, potencial zeta, estabilidade e eficácia de transfecção. As diferenças entre LNPs feitos com mistura pobre (soluções de pipetagem) em comparação com a mistura CIJ também são apresentadas.
A terapêutica baseada em mRNA tem grande potencial para o tratamento e prevenção de uma ampla gama de doenças, incluindo doenças infecciosas, distúrbios genéticos e cânceres1. Ao contrário da terapêutica de moléculas pequenas, que pode se difundir passivamente através da membrana celular, os ácidos nucléicos devem ser encapsulados para entrega intracelular2. O encapsulamento fornece estrutura e estabilidade ao mRNA, facilitando sua entrega intracelular por vias endocíticas, bem como evitando a degradação de componentes intra e extracelulares, como nucleases3. Uma série de materiais e nanocarreadores foram desenvolvidos para o encapsulamento e entrega de mRNA, incluindo nanopartículas inorgânicas, polímeros, lipídios e materiais semelhantes a lipídios1. Entre estes, os LNPs emergiram como a plataforma de entrega mais proeminente para terapias baseadas em mRNA4.
Os LNPs são compostos por quatro componentes lipídicos: lipídio ionizável, colesterol, lipídio zwitteriônico e estabilizador lipídico PEG5. Os lipídios ionizáveis adequados para entrega de mRNA exibem um equilíbrio cuidadoso entre a hidrofobicidade lipídica e a constante de dissociação (pKa) de um grupo amina ternária6. O pKa lipídico ionizável normalmente tem um pH entre 6,0 e 6,7, como KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) e ALC-03157. Essa restrição de pKa no lipídio ionizável permite tanto o encapsulamento de polímeros de ácidos nucleicos como sais lipídicos hidrofóbicos quanto a entrega intracelular por meio de um processo de "escape de endossomos". Os LNPs entram em uma célula-alvo através de (várias) vias de endocitose que envolvem a acidificação do endossomo de pH 7,4 a pH ~ 58. O pKa lipídico ionizável garante que os LNPs tenham superfícies quase neutras em condições fisiológicas, mas se tornem catiônicos em um endossomo acidificante9. Essa resposta de pH permite a ruptura seletiva apenas da membrana endossômica, a liberação do polímero de ácido nucleico encapsulado e preserva a viabilidade celular, ao contrário dos lipídios catiônicos permanentemente usados em sistemas de transfecção como a lipofectamina. O colesterol é uma molécula intersticial hidrofóbica na estrutura do LNP que melhora a fluidez lipídica. O lipídio zwitteriônico desempenha um papel estrutural e forma uma bicamada na superfície do LNP. O poli(etilenoglicol)-lipídio (PEG-lipídio) é um estabilizador coloidal que aumenta a estabilidade do LNP, conferindo um estabilizador estérico polimérico na superfície do LNP, que resiste à agregação de LNPs. Isso estabiliza o LNP, particularmente durante as mudanças no pH que regeneram a forma de base livre do lipídio ionizável que se comporta como um óleo hidrofóbico. A receita de Onpattro (patisiran) (doravante, referida como formulação LNP) é frequentemente usada como ponto de partida para a formulação de LNP com lipídio ionizável MC3, colesterol, distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e PEG2000-DMG dissolvido em etanol misturado contra uma solução aquosa de RNA10.
Várias técnicas podem ser usadas para fabricar LNPs encapsulando polímeros de ácido nucleico, com a maioria delas contando com um tema comum de misturar rapidamente um fluxo de etanol contendo lipídios com um fluxo aquoso incorporando o ácido nucléico de interesse (siRNA, mRNA ou DNA) 9 , 11 , 12 , 13 , 14. Nesse sentido, os processos de mistura em massa, como a mistura de pipetas e a mistura de vórtices, oferecem uma estratégia simples para formar LNPs que elimina a necessidade de usar instrumentos sofisticados12. No entanto, a mistura em massa não fornece uma distribuição homogênea de componentes, levando a uma distribuição de tamanho LNP abaixo do ideal, juntamente com uma variabilidade significativa de lote para lote15.
Os laboratórios usam rotineiramente técnicas de mistura microfluídica para obter LNPs reprodutíveis, obtendo um controle mais preciso sobre as condições de mistura 12,13,16. No entanto, as condições de fluxo laminar em dispositivos microfluídicos, que são inerentes devido às pequenas escalas de comprimento e baixas velocidades em uma câmara microfluídica, resultam em uma mistura solvente/antissolvente comparativamente lenta17. As dimensões da pequena câmara limitam severamente o rendimento e a escalabilidade necessários para a produção de LNPs GMP, mas os pesquisadores paralelizaram as câmaras microfluídicas para tentar dimensionar os volumes de produção15. Uma geometria microfluídica paralelizada não elimina o problema de adsorção de lipídios em superfícies durante o processamento de grandes volumes, um problema comumente referido como "incrustação" do dispositivo de mistura, e há problemas com uniformidade e estabilidade de fluxos que tornam o aumento de escala microfluídica desafiador para a produção em escala industrial18,19. Não é surpreendente que as empresas farmacêuticas tenham usado misturadores de jato turbulentos para fabricar mRNA-LNPs de vacinação COVID-1920.
O processo de produção de LNPs carregados de RNA envolve a mistura de um fluxo tampão aquoso contendo a carga útil de RNA com um fluxo de etanol contendo os quatro componentes lipídicos distintos. Essas formulações utilizam um tampão ácido com pH de 4,0 ou menos, que carrega o lipídio ionizável à medida que os fluxos aquoso e etanólico se misturam. Os lipídios ionizáveis carregados positivamente interagem eletrostaticamente com os RNAs carregados negativamente, formando um sal lipídico de RNA hidrofóbico. Espécies lipídicas hidrofóbicas, incluindo o sal lipídico de RNA, precipitam nos solventes mistos e formam núcleos hidrofóbicos. Esses núcleos crescem através da precipitação de lipídios e colesterol zwitteriônicos até atingir um ponto crítico onde lipídios peguilados suficientes são adsorvidos na superfície dos LNPs, interrompendo o crescimento adicional - nucleação e mecanismo de crescimento21 , 22 , 23 . A adição de tampão aquoso à solução lipídica, na medida em que os lipídios precipitam e os LNPs se formam, depende de duas escalas de tempo distintas: o período de mistura solvente-antissolvente, τmix, e o período de crescimento dos núcleos, τagg. O número de Damköhler adimensional, definido como Da = τmix/τagg, captura a interação entre essas escalas de tempo24. Em casos de mistura lenta (Da > 1), o tamanho final dos LNPs é controlado por transporte e varia com o tempo de mistura. Por outro lado, durante a mistura rápida (Da < 1), o fluido é fragmentado em estrias ou camadas de comprimento de Kolmogrov, em que a formação de LNP é governada exclusivamente pela difusão molecular de cada constituinte, resultando em cinética homogênea de formação de LNP. Alcançar este último cenário exige que a concentração lipídica exceda um limite crítico, estabelecendo um estado de supersaturação propício à nucleação homogênea uniforme.
Estima-se que τagg varia de algumas dezenas a algumas centenas de milissegundos25. Em sua configuração mais básica, os dois fluxos, um contendo etanol com lipídios e outro contendo um tampão aquoso com carga de RNA, são injetados em uma câmara conhecida como misturador de "jato de impacto confinado" (CIJ). Os vórtices turbulentos produzem escalas de comprimento de estriação solvente/antissolvente de 1 μm em 1,5 ms quando operados em velocidades apropriadas. As velocidades dos fluxos e a geometria de mistura determinam a conversão do momento linear em vórtices turbulentos que misturam os fluxos. Isso é parametrizado pelo número adimensional, o número de Reynolds (Re), que é linearmente proporcional às velocidades do fluxo. Re é calculado a partir de Re = Σ (ViDi / vi), onde Vi é a velocidade do fluxo em cada vapor, vi é a viscosidade cinemática de cada fluxo e Di é o diâmetro de entrada do fluxo em dispositivos CIJ de 2 jatos26 ou o diâmetro da câmara em MIVMs de 4 jatos27. Nota: Algumas referências para o CIJ usam apenas um único diâmetro e velocidade do jato para definir Re28. Re está na faixa de 1-100 em um dispositivo microfluídico, enquanto nos dispositivos CIJ, Re de 125.000 pode ser alcançado. Em um misturador CIJ, fluxos com momento igual colidem, dissipando seu momento com o impacto como mistura turbulenta, o que leva a uma micromistura eficiente devido às pequenas microescalas de Kolmogorov e ao pequeno número de Damköhler. Outro tipo de mixer é o "mixer de vórtice de entrada múltipla" (MIVM), onde quatro fluxos são direcionados para uma câmara central. Nesta configuração, fluxos contínuos para a câmara de mistura confinada garantem uma escala de tempo de mistura bem definida. Todos os elementos fluidos passam pela zona de mistura de alta energia em ambos os tipos de misturadores. Em contraste, dispositivos de mistura simples, como junções em T, não contêm uma câmara que forneça uma zona de mistura, resultando em menos mistura dos dois fluxos devido ao momento do fluxo de entrada ser amplamente desviado para a direção de saída, em vez de para a geração de vórtices turbulentos. Os misturadores CIJ e MIVM podem ser operados em batelada ou contínuos, oferecendo flexibilidade para a produção de LNP em várias escalas.
Este protocolo descreve como as formulações ideais de LNP são feitas empregando duas tecnologias de jato de impacto confinado: CIJ de 2 jatos e misturadores MIVM de 4 jatos. A operação dos misturadores CIJ e MIVM foi demonstrada anteriormente para a preparação de NPs com materiais de núcleo hidrofóbico29. Esse artigo e vídeo devem ser consultados como um recurso adicional sobre a formação de NPs com esses mixers. Esta atualização se concentra na formação de NP à base de lipídios. A capacidade de ajustar o tamanho dos LNPs variando as condições de micromistura é demonstrada. Além disso, é demonstrada a utilidade das tecnologias CIJ na formação de LNPs estáveis e monodispersos com eficiências de transfecção in vitro aprimoradas em células HeLa quando comparadas a LNPs feitas com mistura de pipeta pobre. Além disso, são discutidas as vantagens e desvantagens de cada geometria de mistura CIJ, juntamente com as condições apropriadas necessárias para o aumento de escala desses misturadores.
Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de tampões, fluxos de solventes e antissolventes
2. Formulação de LNPs usando um misturador CIJ de dois jatos
3. Formulação de LNPs usando um misturador MIVM de quatro jatos
4. Pós-processamento de LNPs
5. Caracterização de LNPs
A triagem de formulações ideais de LNP pode ser rapidamente alcançada com quantidades relativamente pequenas de material usando misturadores turbulentos CIJ de dois fluxos, desde que sejam operados em velocidades apropriadas. Um misturador μMIVM acionado por uma bomba de seringa programável, conforme ilustrado na Figura 3A, é utilizado para destacar a importância de obter micromistura suficiente, acima de um número crítico de Reynolds para formar LNPs pequenos e monodispersos. A Tabela 3 contém o resumo das formulações usadas para produzir LNPs, e a configuração do misturador segue o protocolo descrito na etapa 3.4. Os tamanhos de LNP foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz (DLS) em função do número de Reynolds. Conforme mostrado na Figura 3B, além de um Re crítico de 5000, LNPs pequenos e monodispersos são observados. Além disso, números altos de Reynolds (~ 10 4-105) podem ser acessados quando as seringas são pressionadas uniformemente por operação manual ou usando o suporte de mistura (ponto de dados mais à direita na Figura 3B). O suporte de mistura, mostrado na Figura 2A, pressiona uniformemente todas as seringas simultaneamente27. Como resultado, esses LNPs também têm tamanhos ideais. Com mistura inadequada (ou seja, muito pequena de um Re), LNPs maiores são formados. Fotos representativas de LNPs formadas em baixa (Foto 1) e alta Re (Foto 2) são mostradas na Figura 3B. As amostras feitas em baixa Re são turvas, indicando a presença de grandes estruturas de espalhamento de luz coloidal (efeito Tyndall), mas os LNPs formados em alta Re parecem claros devido ao espalhamento mais fraco e deslocado para o azul de colóides menores.
Os lipídios ionizáveis têm diferentes propriedades físico-químicas, que afetam as propriedades físico-químicas dos LNPs produzidos com formulações lipídicas idênticas. Um misturador CIJ (Figura 1A) é usado para testar isso. A Tabela 4 lista as formulações feitas com dois lipídios ionizáveis aprovados pela FDA: ALC-0315 e MC3. A Figura 4A mostra que os LNPs feitos em pH 5 de ALC-0315 são ~ 80 nm, enquanto os LNPs feitos usando MC3 são ~ 60 nm. Além disso, em pH 5, os MC3-LNPs têm um potencial zeta positivo (~ 28 mV), enquanto os ALC-LNPs têm um potencial zeta neutro (<10 mV). Essa distinção na carga de superfície, bem como no tamanho geral dos LNPs, surge do pKa dos dois lipídios. O MC3 apresenta maior pKa (6,44) quando comparado ao ALC0315 (6,09)32; portanto, uma fração maior de lipídios MC3 é carregada em pH 5. Ambas as formulações têm estabilizador lipídico PEG-1,5 mol%; no entanto, os MC3-LNPs se estabilizam em um tamanho menor devido a maiores repulsões eletrostáticas durante a montagem do LNP durante a agregação limitada por difusão, o que interrompe o crescimento no tamanho menor. Ambas as formulações apresentam altas eficiências de encapsulamento (>90%), conforme mostrado na Figura 4B. A química dos lipídios é crucial para determinar as propriedades gerais, bem como o desempenho dos LNPs e, portanto, eles devem ser escolhidos cuidadosamente com base na aplicação alvo.
Os LNPs feitos usando ambas as geometrias do misturador turbulento (etapa 2.3 e etapa 3.3) têm propriedades físico-químicas semelhantes. Essa comparação é estendida aos LNPs feitos a partir de técnicas de mistura inadequadas, como a mistura de pipetas a granel, para ilustrar ainda mais a distinção entre misturadores turbulentos e técnicas de mistura não uniformes (Figura 1C). A Tabela 5 fornece o resumo das formulações usadas para fazer LNPs, conforme mostrado na Figura 5. No caso da técnica de mistura de pipetas, volumes iguais de etanol e fluxos aquosos são rapidamente misturados pipetando para cima e para baixo por 15-20 s, seguido de pipetagem da mistura em um banho tampão de acetato a pH 4. A Figura 5A mostra que os tamanhos dos LNPs no banho tampão de acetato de têmpera de 10 mM (pH 4, 10 vol% de etanol) são notavelmente semelhantes e pequenos (~ 50 nm), independentemente da geometria do misturador usada (CIJ ou MIVM). No entanto, os LNPs feitos com mistura de pipetas têm o dobro do tamanho dos LNPs feitos com misturadores turbulentos. Isso mostra que os LNPs feitos de diferentes geometrias CIJ exibem propriedades semelhantes quando feitos em velocidades suficientemente altas (regime turbulento acima do número crítico de Reynolds), enquanto a mistura ruim resulta em LNPs maiores e polidispersos.
Em seguida, os LNPs são dialisados contra um tampão HEPES de 10 mM, pH 7,4 (100x o volume), para remover o etanol e mudar o pH para 7,4. Durante esse processo, há alguma fusão e crescimento do LNP para um tamanho ligeiramente maior, conforme mostrado na Figura 5A, que está de acordo com o mecanismo de fusão bem estudado na literatura33. No geral, os LNPs feitos usando misturadores CIJ e MIVM têm menos de 100 nm, enquanto os LNPs feitos com mistura de pipetas têm cerca de 140 nm. Como mostrado na Figura 5B, os potenciais zeta para essas formulações são inferiores a 10 mV, indicando que todos são neutros em pH 7,4. Além disso, todos eles mostram altas eficiências de encapsulamento de >95% (Figura 5C). Assim, os LNPs com propriedades físico-químicas ideais podem ser facilmente fabricados usando tecnologias de misturadores turbulentos. O desempenho desses LNPs é avaliado pela realização de transfecção in vitro em células HeLa.
O protocolo de ensaio de transfecção in vitro baseado em luciferase é adotado de uma publicação anterior34. A Figura 6A representa graficamente a luminescência (RLU) por 1000 células para as três formulações resumidas na Tabela 5. A lipofectamina 3000 é usada como controle positivo. É importante notar que a lipofectamina 3000 é geralmente usada para formulações de DNA; no entanto, funcionou como um controle adequado nesses experimentos. Os LNPs feitos usando misturadores CIJ de 2 jatos e MIVM de 4 jatos transfectam muito melhor do que os LNPs feitos usando mistura de pipetas. Embora se espere que as partículas maiores transfectem melhor do que as partículas pequenas devido à maior carga útil por LNP, os LNPs feitos usando a mistura de pipetas aqui transfectam de forma menos eficaz. Isso implica claramente que há uma diferença significativa nas estruturas dos LNPs feitos com tecnologias CIJ em comparação com os LNPs feitos com mistura de pipetas. As eficiências de transfecção de LNPs feitas com misturadores CIJ e MIVM são essencialmente idênticas. A lipofectamina 3000 apresenta a menor eficiência de transfecção. A Figura 6B avalia a toxicidade do LNP in vitro em células HeLa usando um ensaio de viabilidade celular baseado em sal de resazurina sódica35. Todas as formulações apresentam baixa citotoxicidade, exibida por altos níveis de viabilidade celular quando plotadas como uma porcentagem de células vivas versus o controle que não possui nenhum tratamento com nanopartículas.
Figura 1: Métodos de mistura para produção de LNPs. (A) O misturador de jato de impacto confinado de dois jatos (CIJ) mostrando uma fotografia de um misturador transparente e uma configuração de misturador Delrin montada regularmente usada em laboratório. (B) O misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM) mostrando uma fotografia de um misturador transparente e uma configuração montada de aço inoxidável e misturador Delrin. Os fluxos de entrada do misturador transparente foram movidos para os lados do misturador para melhor visualização da geometria da mistura, enquanto no misturador prático, os fluxos de entrada entram pela parte superior. Tanto o CIJ quanto o μMIVM operam com velocidade de líquido suficiente para que os fluxos estejam no regime turbulento, e a mistura produz microescalas de Kolmogorov menores que 1 μm, o que permite a obtenção de supersaturação em ~ 1,5 ms. (C) A configuração de mistura de pipetas amplamente utilizada para preparar pequenos volumes de dispersões de LNP misturando soluções aquosas e etanólicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Vista expandida do μMIVM e seu suporte de mixagem. (A) μMIVM montado, com seringas de vidro, sob o suporte do misturador que facilita a depressão uniforme e rápida das seringas. Essa figura é reproduzida de Markwalter et al.29. (B) μMIVM desmontado mostrando os componentes internos. Essa geometria de mistura é idêntica ao misturador transparente na Figura 1B, exceto que os fluxos de entrada entram pelo disco superior e não pela superfície cilíndrica lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O aumento do número de Reynolds em um misturador turbulento diminui o diâmetro hidrodinâmico do LNP até um número de Reynolds crítico de platô. (A) Representação esquemática da bomba de seringa e configuração do μMIVM usada para controlar o número de Reynolds no misturador turbulento, definindo as taxas de fluxo volumétrico. (B) Diâmetro hidrodinâmico LNP versus número de Reynolds no MIVM. O aumento do número de Reynolds e da dissipação de energia turbulenta melhora a mistura e leva a uma mistura mais homogênea, supersaturação e crescimento de partículas. Acima do número crítico de Reynolds, os tamanhos de LNP permanecem constantes com taxas de fluxo crescentes devido à condição Da<<1, ou seja, o tempo de difusão do solvente/antissolvente é menor que o tempo de montagem do NP. As taxas de fluxo fornecidas são as taxas de fluxo totais de todos os quatro fluxos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Propriedades coloidais de LNPs produzidos com diferentes lipídios ionizáveis. (A) Diâmetros hidrodinâmicos e potenciais zeta de LNPs produzidos com dois lipídios ionizáveis diferentes: ALC-0315 e MC3. As medições são feitas em pH 5 no banho de têmpera após a formação de LNP. Diferenças no pKa aparente dos lipídios ionizáveis afetam as propriedades coloidais dos LNPs. (B) Medições de eficiência de encapsulamento de ambos os LNPs (n = 3, barras de erro representam um desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Propriedades coloidais de LNPs produzidos com diferentes misturadores encapsulando o mRNA da luciferase usando lipídio ionizável MC3. (A) Diâmetros hidrodinâmicos de LNPs produzidos com misturadores de 2 jatos, 4 jatos e pipetas. As medições são realizadas sob as condições ácidas do banho de têmpera após a formação de LNP (lado esquerdo) e após diálise em um tampão HEPES neutro (lado direito). O tamanho do LNP cresce durante a neutralização do pH devido à deionização do lipídio ionizável, levando à fusão e crescimento do LNP. O estabilizador lipídico-PEG interrompe o crescimento da coalescência dessa partícula antes da formação de precipitados do tamanho de mícrons. (B) Medições de carga de superfície (como o potencial ζ) em LNPs dialisados no HEPES de 10 mM, condição de pH 7,4. Todos os LNPs estão dentro de 2 mV de 0 mV, o que indica que essas superfícies de partículas são neutras e têm apenas uma quantidade quase indetectável de carga catiônica. (C) Medições de eficiência de encapsulamento após diálise de LNPs (n = 3, barras de erro representam um desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Transfecção de células HeLa com LNPs preparados. (A) Luminescência da enzima luciferase expressa após tratamento com luciferina. (B) Viabilidade das células HeLa após incubação com LNPs. As células não mostram alteração estatisticamente significativa na viabilidade, conforme indicado por um ensaio metabólico de resazurina (n = 4, as barras de erro representam um desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Fluxo(s) / Banho de têmpera | Componente | Formulação | Estoque | Volume |
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3) | 50 mol% | 50 mg/ml | 0,5 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA) | RNA de levedura | N/P 6 | 10 mg/ml | 0,5 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | ||
Banho de têmpera | Tampão de acetato | 10 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | 4 mL |
Tabela 1: Formulação padrão de LNP de patisirana produzida por um misturador CIJ. O RNA de levedura é usado como RNA modelo para este protocolo. Todas as soluções são dissolvidas molecularmente e misturadas completamente antes de serem colocadas nas seringas.
Fluxo(s) / Banho de têmpera | Componente | Formulação | Estoque | Volume |
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3) | 50 mol% | 50 mg/ml | 0,5 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA) | RNA de levedura | N/P 6 | 10 mg/ml | 0,5 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | ||
Seringa 3 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3) | 50 mol% | 50 mg/ml | 0,5 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 4 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA) | RNA de levedura | N/P 6 | 10 mg/ml | 0,5 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | ||
Banho de têmpera | Tampão de acetato | 10 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | 8 mL |
Tabela 2: Formulação padrão de LNP de patisiran produzida por um misturador MIVM. Um misturador MIVM utiliza quatro fluxos - dois solventes e dois antissolventes. Córregos com momentos desiguais podem ser usados; no entanto, fluxos com momentos iguais são escolhidos para este protocolo.
Fluxo(s) / Banho de têmpera | Componente | Formulação | Estoque | Volume |
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3) | 50 mol% | 50 mg/ml | 20 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA) | RNA de levedura | N/P 6 | 10 mg/ml | 20 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | ||
Seringa 3 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3) | 50 mol% | 50 mg/ml | 20 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 4 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA) | RNA de levedura | N/P 6 | 10 mg/ml | 20 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | ||
Banho de têmpera (Hora de coleta = 30 s) | HEPES Buffer | 10 mM, pH 7,5 | 1 m, pH 7,5 | 320 mL |
Tabela 3: Formulação LNP produzida por um misturador MIVM acionado por uma bomba de seringa. O DODMA é usado como um lipídio ionizável junto com o RNA de levedura como RNA modelo. Um exemplo executado com 40 mL/min é escolhido para este protocolo.
Fluxo(s) / Banho de têmpera | Componente | Formulação | Estoque | Volume |
Seringa 1 - Fluxo de etanol (12 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3 ou ALC0315) | 50 mol% | 50 mg/ml | 0,5 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,6 mg/mL de RNA) | RNA de levedura | N/P 6 | 10 mg/ml | 0,5 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 5 | 100 mM, pH 5 | ||
Banho de têmpera | Tampão de acetato | 10 mM, pH 5 | 100 mM, pH 5 | 9 mL |
Tabela 4: Formulações LNP de dois lipídios ionizáveis diferentes produzidos por um misturador CIJ. As formulações são feitas de ALC-0315 ou MC3, enquanto todos os outros componentes são mantidos iguais.
Fluxo(s) / Banho de têmpera | Componente | Formulação | Estoque | Volume |
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais) | Lipídio ionizável (MC3) | 50 mol% | 50 mg/ml | 0,5 mL |
Lipídio de Zwitterion (DSPC) | 10 mol% | 5 mg/ml | ||
Colesterol | 38,5 mol% | 5 mg/ml | ||
Lipídio peguilado (DMG-PEG2000) | 1,5 mol% | 4 mg/ml | ||
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA) | mRNA FLuc | N/P 6 | 1 mg/ml | 0,5 mL |
Tampão de acetato | 20 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | ||
Banho de têmpera | Tampão de acetato | 10 mM, pH 4 | 100 mM, pH 4 | 4 mL |
Tabela 5: Formulação padrão de LNP de patisirana produzida por um misturador CIJ. O mRNA FLuc que expressa uma proteína luciferase é empregado para medir a expressão gênica usando um ensaio de bioluminescência.
Arquivo Suplementar 1: Fornecedores de Misturadores CIJ e MIVM. Clique aqui para baixar este arquivo.
A síntese de LNPs contendo polímeros de ácidos nucleicos usando dois misturadores turbulentos de jato de impacto confinado foi apresentada. Quando conduzidos em velocidades apropriadas, os misturadores turbulentos CIJ garantem que a escala de tempo de mistura seja menor que o tempo de montagem do LNP, produzindo condições homogêneas de supersaturação para formar pequenos LNPs com distribuições de tamanho estreitas21. Consequentemente, os LNPs feitos com a mesma química usando diferentes geometrias de misturador turbulento (o CIJ de 2 jatos e o misturador MIVM de 4 jatos) exibem propriedades físico-químicas semelhantes e mostram boas eficiências de transfecção (Figura 5 e Figura 6). Em contraste, os LNPs feitos usando pipetagem que produz uma mistura mais pobre resultam em LNPs maiores e mais polidispersos (Figura 5A) com menores eficiências de transfecção. Há muito se entende que a cinética de mistura e montagem desempenha um papel significativo no processamento de LNP; Cullis et al. observaram que a mistura convectiva-difusiva rápida de etanol e tampão leva à formação de partículas pequenas com uma distribuição de tamanho estreita, enquanto a mistura difusiva lenta leva a partículas maiores com distribuições de tamanho amplas9. A escala de tempo de mistura em misturadores turbulentos CIJ diminui proporcionalmente às taxas de fluxo de entrada dos fluxos para o misturador27. Isso é quantificado pelo número de Reynolds adimensional (Re), que mede a razão entre as forças inercial e viscosa. A turbulência dentro das câmaras de mistura do CIJ e MIVM ocorre em Re suficientemente alto, de modo que o alongamento turbulento do vórtice resulta em pequenas escalas de comprimento que produzem rápida mistura solvente / antissolvente por difusão. A escala de comprimento turbulento depende do Re e não da geometria específica do dispositivo de mistura. É por isso que o CIJ ou o MIVM produzem as mesmas partículas LNP e por que vários tamanhos de misturadores MIVM produzem os mesmos tamanhosNP 27. Em alta Re, correspondendo a altas velocidades de entrada, os LNPs podem ser feitos de forma reprodutível sem variações de lote para lote ( Figura 3B ).
Este protocolo permite a formulação de uma variedade de LNPs de mRNA, DNA ou siRNA com diferentes propriedades físico-químicas usando misturadores CIJ turbulentos. Além de permitir versatilidade na composição e nas concentrações, essa técnica fornece um caminho claro para selecionar rapidamente as formulações na venda em bancada (alguns miligramas) e aumentar as formulações de chumbo para lotes industriais maiores a taxas de produção de 5 L/min36. Este tem sido um grande obstáculo para várias outras técnicas, incluindo mistura em massa e microfluídica. Por exemplo, as técnicas de processamento em massa não conseguem fabricar LNPs de forma reprodutível de forma consistente, mesmo em escalas de alguns mililitros. As técnicas microfluídicas fornecem uma melhoria significativa em relação às técnicas de mistura a granel para permitir a produção de LNPs uniformes e reprodutíveis; no entanto, eles estão apenas na faixa de miligramas29. Conforme detalhado na introdução, a paralelização de dispositivos microfluídicos fornece uma tentativa de escalonamento para escalas de produção, mas não elimina o problema de incrustação, e não pode ser dimensionada com tanto sucesso quanto os misturadores baseados na tecnologia de jato de colisão confinada.
Além dessas vantagens, os misturadores CIJ serão fundamentais na fabricação de LNPs de próxima geração que exibem recursos de direcionamento ou realizam edição de genes. As formulações atuais de LNP têm lipídios e ácidos nucléicos que têm difusividades semelhantes e, portanto, podem ser feitas mesmo com uma mistura ligeiramente pobre em escala de bancada. No entanto, as abordagens de edição de genes podem exigir o encapsulamento de espécies de ácidos nucléicos com pesos moleculares amplamente diferentes, como pequenas moléculas de RNA guia e grandes transcritos de mRNA, para codificar uma proteína CAS937. As escalas de tempo de difusão muito diferentes dessas diferentes espécies tornam desafiador o encapsulamento uniforme em proporções estequiométricas. Este problema de encapsulamento uniforme torna-se mais pronunciado à medida que a eficiência da mistura se torna mais pobre. Da mesma forma, o direcionamento de células não hepáticas pode precisar da incorporação de estabilizadores de difusão lenta fortemente ligados (como copolímeros de bloco de grande peso molecular com ligantes direcionados). Ligantes direcionados de até 14 kDa podem ser conjugados para bloquear copolímeros antes da montagem das nanopartículas, o que permite sua incorporação uniforme em NPs usando a mistura CIJ38. Os misturadores turbulentos CIJ são ferramentas úteis para a fabricação de LNPs feitos com componentes com diferentes difusividades.
Embora os misturadores turbulentos CIJ demonstrem várias vantagens sobre outros misturadores para a formulação de LNPs, é importante observar as limitações associadas a cada geometria. O misturador CIJ de 2 jatos requer que ambos os fluxos de entrada (etanol e água) tenham momentos iguais (dentro de 10% -30%) para obter uma micromistura turbulenta uniforme na câmara. O facto de a corrente de saída ser composta por solvente/antissolvente 50:50 limita o nível de supersaturação na cavidade de mistura onde ocorre a precipitação29. Essa desvantagem é abordada pelo misturador MIVM de 4 jatos, pois ele pode utilizar quatro jatos com momentos desiguais para atingir condições de alta supersaturação na câmara de mistura. Além disso, ambos os misturadores devem estar na ordem de miligramas de massa total, tornando-os uma escolha não ideal para triagem de alto rendimento de muitas formulações diferentes de LNP. Para formulações simples de LNP, a triagem pode ser melhor feita com microfluídica ou estratégias de pipetagem em escalas de microgramas e, em seguida, transferida para a tecnologia de jato de impacto confinado quando algumas formulações de chumbo forem identificadas. Também é crucial considerar os volumes mortos nos misturadores. No CIJ, dois misturadores a jato, os volumes de retenção são de 50 a 100 microlitros. Essa quantidade de material deve ser subtraída da quantidade capturada no banho de têmpera ao calcular a recuperação do processo. Essas perdas são insignificantes quando operam em grandes escalas, mas seriam responsáveis por perdas de 10% quando volumes totais de 5 mL são produzidos, como mostrado aqui. Os misturadores turbulentos a jato de impacto são uma ferramenta valiosa para a produção de LNPs na escala GMP, conforme evidenciado pelas duas vacinas COVID-19 aprovadas pela FDA.
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
NSF Fellowship para BKW (DGA1148900), apoio da Tessera Therapeutics Inc., da Fundação Bill e Melinda Gates (BMGF, números de contrato OPP1150755 e INV-041182) e da FDA sob o prêmio 75F40122C00186.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18:0 PC (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365P | Helper lipid |
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Fisher Scientific | 165306 | |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | A38-212 | |
ALC-0315 | Avanti Polar Lipids | 890900 | Ionizable lipid |
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL | Millipore Sigma | UFC910024 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL | Millipore Sigma | UFC810096 | |
Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2620 | |
Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
CleanCap FLuc mRNA (5 moU) | Trilink Biotechnologies | L-7202 | |
Confined Impinging Jets Mixer | Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD) | N/A | Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation |
D-Lin-MC3-DMA | MedChemExpress | HY-112251 | Ionizable lipid |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
DMG-PEG 2000 | Avanti Polar Lipids | 880151P | PEG-lipid |
DODMA | Avanti Polar Lipids | 890899P | Ionizable lipid |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
HeLa | ATCC | CCL-2 | |
HEPES, free acid | IBI Scientific | IB01130 | |
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock | Henke Sass Wolf | 4050.X00V0 | |
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID | Idex Health & Science | 1648 | |
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting | Idex Health & Science | P-678 | |
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing | Idex Health & Science | P-940 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
Luer fitting | Idex Health & Science | P-604 | Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers |
Mixer stand | Holland Applied Technologies | N/A | See Markwalter & Prud'homme for design.26 Contact Holland for Purchase |
Multi-Inlet Vortex Mixer | Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD) | N/A | Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation |
O-ring (MIVM) | C.E. Conover | MM1.5 35.50 V75 | Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source. |
Outlet ferrule - CIJ | Idex Health & Science | P-200 | Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing) |
Outlet fitting - CIJ | Idex Health & Science | P-205 | Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet |
Outlet fitting - MIVM | Idex Health & Science | P-942 | Combination with ferrule |
Outlet tubing - CIJ | Idex Health & Science | 1517 | Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber |
Outlet tubing - MIVM | N/A | N/A | Fit to ferrule ID. |
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PHD 2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | N/A | |
Plastic two-piece syringe 1 mL | Thermo Fisher Scientific | S7510-1 | |
Plug fitting | Idex Health & Science | P-309 | Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling) |
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | R11491 | |
Resazurin, Sodium Salt | Thermo Fisher Scientific | R12204 | |
RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7000TS1 | |
Scintillation vial | DWK Lifesciences | 74504-20 | |
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL | SGE | 100MR-LL-GT | |
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL | SGE | 50MR-LL-GT | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 66012 | |
Sodium Acetate | Millipore Sigma | 32319-500G-R | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Sucrose | Millipore Sigma | S7903-1KG | |
Syringe Filters, Sterile | Genesse Scientific | 25-243 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Water, Endotoxin Free | Quality Biological | 118-325-131 | RNAse and DNAse free |
Yeast RNA (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM7118 |
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