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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

在这里,我们描述了一种用于分离和分化小鼠气道上皮细胞的 体外 模型,重点关注它们对慢性香烟烟雾提取物 (CSE) 的适应。该模型可用于全面表征 CSE 的多组学影响,这可能为了解慢性烟雾暴露下的细胞反应提供见解。

Abstract

慢性阻塞性肺病 (COPD) 主要归因于烟草烟雾暴露。研究气道上皮细胞如何在功能上适应烟草烟雾对于了解 COPD 的发病机制至关重要。本研究是使用原代小鼠气道上皮细胞建立一个 体外 模型,以模拟烟草烟雾的现实影响。与已建立的细胞系不同,原代细胞保留了更多的 体内样特性,包括生长模式、衰老和分化。这些细胞表现出敏感的炎症反应和有效的分化,因此与生理状况密切相关。在该模型中,原代小鼠气道上皮细胞在气液界面下以最佳浓度的香烟烟雾提取物 (CSE) 培养 28 天,这导致单层未分化细胞转化为假复层柱状上皮,表明 CSE 驯化。然后应用全面的多组学分析来阐明 CSE 影响基底气道细胞分化的机制。这些见解有助于更深入地了解支撑 COPD 进展以应对烟草烟雾暴露的细胞过程。

Introduction

慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 是一种具有复杂特征的异质性肺部疾病,而 COPD 患者逐渐趋于年轻化1。吸烟是COPD 2 的主要危险因素,对气道上皮细胞有深远影响,气道上皮细胞是抵御烟草烟雾的初始屏障。尽管存在这种已知的关联,但烟草烟雾诱导气道上皮细胞变化的详细机制仍未得到充分探索。彻底了解这些分子改变对于确定 COPD 的早期诊断标志物和治疗靶点至关重要。

为了解决这一差距,我们开发了一种使用小鼠气道上皮细胞的新型体外模型。这些细胞受到香烟烟雾提取物 (CSE) 的长期刺激,使我们能够监测动态细胞变化并探索气道上皮细胞在长期烟草刺激下的变化及其潜在机制。在该模型中,transwell 用于提供气道上皮细胞的气液界面,在上皮细胞分化的早期刺激香烟烟雾提取物,直到 28 天分化结束。以前的研究仅调查了气道上皮细胞的分化和短期刺激 (细胞系优势)。它们仅限于单一的调节途径 3,4,5,6。然而,这里介绍的方案使用原代小鼠气道上皮细胞,并优化了细胞提取过程,以获得比以前的气道上皮细胞培养方法更好的细胞活性。该模型侧....

Protocol

整个方案需要 44 天,包括从小鼠气管中分离的气道上皮细胞的制备 1 天、细胞增殖的 15 天和气液界面 CSE 刺激的 28 天。所有实验动物均饲养在首都医科大学动物实验中心的 SPF 屏障动物室,并经首都医科大学动物实验与实验动物伦理委员会 (AEEI-2020-100) 审查批准,符合 ARRIVE 指南7 的要求。

1. 从小鼠气管中分离原代小鼠气道上皮细胞

  1. ?.......

Representative Results

分化
小鼠气道上皮细胞在气液界面用分化培养基培养 28 天后成功分化。纤毛标志物乙酰化 α-微管蛋白(绿色; 图 3A)和杯状细胞标记物 Mucin5AC,分别为 6(红色; 图 3B)。

测定用于细胞分化的 CSE 浓度
用不同浓度的 CSE 刺激分离的上皮细胞 24 小时。结果表明,当 CSE 浓度高于 6% 时,上皮细胞的细胞活?.......

Discussion

COPD 是一种常见的慢性气道炎症性疾病。暴露于烟草烟雾会导致慢性气道炎症、气道重塑和肺结构破坏,这是各种结构细胞和免疫细胞相互作用的结果10。气道上皮细胞作为肺部先天免疫系统的前线,在疾病的发展过程中起着非常重要的作用11。从这个角度来看,阐明上皮细胞在有害物质的刺激下如何改变和调节下游细胞,是一个亟待解决的科学问题。

Acknowledgements

这项研究得到了中国国家自然科学基金 (82090013) 的支持。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicillin/Streptomycin solutionGibco15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, SterileBIOFILTCS016012
40 µm Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin SolutionGibcoR01510
acetylated α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
Animal Component Free Cell Dissociation KitStemcell05426
Anti-pan Cytokeratin antibodyabcamab7753
CigaretteMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigmaDN25
Ham’s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Solution Stemcell07980
Hydrocortisone Stock SolutionStemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basal Medium
Stemcell05002 
PneumaCult-ALI 10x SupplementStemcell05003 
PneumaCult-ALI Maintenance SupplementStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basal MediumStemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rat tail collagenCorning354236
Trypan BlueStemcell07050 

References

  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I.

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