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Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.
A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é amplamente atribuída à exposição à fumaça do tabaco. Investigar como as células epiteliais das vias aéreas se adaptam funcionalmente à fumaça do tabaco é crucial para entender a patogênese da DPOC. O presente estudo foi estabelecer um modelo in vitro usando células epiteliais primárias das vias aéreas murinas para imitar o impacto da fumaça do tabaco na vida real. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as células primárias retêm mais propriedades semelhantes às in vivo, incluindo padrões de crescimento, envelhecimento e diferenciação. Essas células exibem uma resposta inflamatória sensível e diferenciação eficiente, representando de perto as condições fisiológicas. Nesse modelo, células epiteliais primárias das vias aéreas murinas foram cultivadas por 28 dias sob uma interface ar-líquido com uma concentração ótima de extrato de fumaça de cigarro (CSE), o que levou à transformação de uma monocamada de células indiferenciadas em um epitélio colunar pseudoestratificado, indicativo de aclimatação ao CSE. Análises multiômicas abrangentes foram então aplicadas para elucidar os mecanismos pelos quais o CSE influencia a diferenciação das células basais das vias aéreas. Esses insights fornecem uma compreensão mais profunda dos processos celulares que sustentam a progressão da DPOC em resposta à exposição à fumaça do tabaco.
A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma condição pulmonar heterogênea com características complexas, enquanto os pacientes com DPOC tendem gradualmente a ser mais jovens1. O tabagismo, um fator de risco primário para DPOC2, tem um impacto profundo nas células epiteliais das vias aéreas, que servem como barreira inicial contra a fumaça do tabaco. Apesar dessa associação conhecida, os mecanismos detalhados pelos quais a fumaça do tabaco induz alterações nas células epiteliais das vias aéreas permanecem inadequadamente explorados. Uma compreensão completa dessas alterações moleculares é essencial para identificar ....
O protocolo geral requer 44 dias, incluindo 1 dia para preparação de células epiteliais das vias aéreas isoladas de traqueias murinas, 15 dias para proliferação celular e 28 dias para estimulação de CSE na interface ar-líquido. Todos os animais experimentais estão alojados na Sala de Animais de Barreira SPF do Centro de Experimentos Animais da Capital Medical University e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório e Experimentos Animais da Capital Medical University (AEEI-2020.......
Diferenciação
As células epiteliais das vias aéreas murinas se diferenciaram com sucesso após a cultura em uma interface ar-líquido com um meio de diferenciação por 28 dias. A presença de células ciliadas e caliciformes foi demonstrada pelo ensaio de imunofluorescência do marcador de cílios acetilado α-Tubulina (verde; Figura 3A) e o marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (vermelho; Figura 3B).
A DPOC é uma doença inflamatória crônica comum das vias aéreas. A exposição à fumaça do tabaco leva à inflamação crônica das vias aéreas, remodelação das vias aéreas e destruição estrutural pulmonar, que é o resultado da interação de várias células estruturais e células imunes10. Como linha de frente do sistema imunológico inato no pulmão, as células epiteliais das vias aéreas desempenham um papel muito importante durante o desenvolvimento da doença1.......
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82090013).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100x Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140122 | |
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile | BIOFIL | TCS016012 | |
40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
500x Gentamicin/Amphotericin Solution | Gibco | R01510 | |
acetylated α-Tubulin | CST | #5335 | |
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb | cellsignal | #5335 | |
Animal Component Free Cell Dissociation Kit | Stemcell | 05426 | |
Anti-pan Cytokeratin antibody | abcam | ab7753 | |
Cigarette | Marlboro | ||
Claudin3 | immunoway | YT0949 | |
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | |
Ham’s F-12 | Sigma-Aldrich | N6658 | |
Heparin Solution | Stemcell | 07980 | |
Hydrocortisone Stock Solution | Stemcell | 07925 | |
Mucin 5AC | abcam | ab212636 | |
Occludin | proteintech | 27260-1-AP | |
PBS | Cytosci | CBS004S-BR500 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140122 | |
PneumaCult-ALI Basal Medium | Stemcell | 05002 | |
PneumaCult-ALI 10x Supplement | Stemcell | 05003 | |
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | Stemcell | 05006 | |
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement | Stemcell | 05042 | |
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium | Stemcell | 05041 | |
Pronase E | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Rat tail collagen | Corning | 354236 | |
Trypan Blue | Stemcell | 07050 |
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