Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Summary

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Abstract

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é amplamente atribuída à exposição à fumaça do tabaco. Investigar como as células epiteliais das vias aéreas se adaptam funcionalmente à fumaça do tabaco é crucial para entender a patogênese da DPOC. O presente estudo foi estabelecer um modelo in vitro usando células epiteliais primárias das vias aéreas murinas para imitar o impacto da fumaça do tabaco na vida real. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as células primárias retêm mais propriedades semelhantes às in vivo, incluindo padrões de crescimento, envelhecimento e diferenciação. Essas células exibem uma resposta inflamatória sensível e diferenciação eficiente, representando de perto as condições fisiológicas. Nesse modelo, células epiteliais primárias das vias aéreas murinas foram cultivadas por 28 dias sob uma interface ar-líquido com uma concentração ótima de extrato de fumaça de cigarro (CSE), o que levou à transformação de uma monocamada de células indiferenciadas em um epitélio colunar pseudoestratificado, indicativo de aclimatação ao CSE. Análises multiômicas abrangentes foram então aplicadas para elucidar os mecanismos pelos quais o CSE influencia a diferenciação das células basais das vias aéreas. Esses insights fornecem uma compreensão mais profunda dos processos celulares que sustentam a progressão da DPOC em resposta à exposição à fumaça do tabaco.

Introduction

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma condição pulmonar heterogênea com características complexas, enquanto os pacientes com DPOC tendem gradualmente a ser mais jovens¹. O tabagismo, um fator de risco primário para DPOC², tem um impacto profundo nas células epiteliais das vias aéreas, que servem como barreira inicial contra a fumaça do tabaco. Apesar dessa associação conhecida, os mecanismos detalhados pelos quais a fumaça do tabaco induz alterações nas células epiteliais das vias aéreas permanecem inadequadamente explorados. Uma compreensão completa dessas alterações moleculares é essencial para identificar ....

Protocol

O protocolo geral requer 44 dias, incluindo 1 dia para preparação de células epiteliais das vias aéreas isoladas de traqueias murinas, 15 dias para proliferação celular e 28 dias para estimulação de CSE na interface ar-líquido. Todos os animais experimentais estão alojados na Sala de Animais de Barreira SPF do Centro de Experimentos Animais da Capital Medical University e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório e Experimentos Animais da Capital Medical University (AEEI-2020.......

Discussion

A DPOC é uma doença inflamatória crônica comum das vias aéreas. A exposição à fumaça do tabaco leva à inflamação crônica das vias aéreas, remodelação das vias aéreas e destruição estrutural pulmonar, que é o resultado da interação de várias células estruturais e células imunes¹⁰. Como linha de frente do sistema imunológico inato no pulmão, as células epiteliais das vias aéreas desempenham um papel muito importante durante o desenvolvimento da doença^1.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050