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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Abstract

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é amplamente atribuída à exposição à fumaça do tabaco. Investigar como as células epiteliais das vias aéreas se adaptam funcionalmente à fumaça do tabaco é crucial para entender a patogênese da DPOC. O presente estudo foi estabelecer um modelo in vitro usando células epiteliais primárias das vias aéreas murinas para imitar o impacto da fumaça do tabaco na vida real. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as células primárias retêm mais propriedades semelhantes às in vivo, incluindo padrões de crescimento, envelhecimento e diferenciação. Essas células exibem uma resposta inflamatória sensível e diferenciação eficiente, representando de perto as condições fisiológicas. Nesse modelo, células epiteliais primárias das vias aéreas murinas foram cultivadas por 28 dias sob uma interface ar-líquido com uma concentração ótima de extrato de fumaça de cigarro (CSE), o que levou à transformação de uma monocamada de células indiferenciadas em um epitélio colunar pseudoestratificado, indicativo de aclimatação ao CSE. Análises multiômicas abrangentes foram então aplicadas para elucidar os mecanismos pelos quais o CSE influencia a diferenciação das células basais das vias aéreas. Esses insights fornecem uma compreensão mais profunda dos processos celulares que sustentam a progressão da DPOC em resposta à exposição à fumaça do tabaco.

Introduction

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma condição pulmonar heterogênea com características complexas, enquanto os pacientes com DPOC tendem gradualmente a ser mais jovens1. O tabagismo, um fator de risco primário para DPOC2, tem um impacto profundo nas células epiteliais das vias aéreas, que servem como barreira inicial contra a fumaça do tabaco. Apesar dessa associação conhecida, os mecanismos detalhados pelos quais a fumaça do tabaco induz alterações nas células epiteliais das vias aéreas permanecem inadequadamente explorados. Uma compreensão completa dessas alterações moleculares é essencial para identificar ....

Protocol

O protocolo geral requer 44 dias, incluindo 1 dia para preparação de células epiteliais das vias aéreas isoladas de traqueias murinas, 15 dias para proliferação celular e 28 dias para estimulação de CSE na interface ar-líquido. Todos os animais experimentais estão alojados na Sala de Animais de Barreira SPF do Centro de Experimentos Animais da Capital Medical University e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório e Experimentos Animais da Capital Medical University (AEEI-2020.......

Representative Results

Diferenciação
As células epiteliais das vias aéreas murinas se diferenciaram com sucesso após a cultura em uma interface ar-líquido com um meio de diferenciação por 28 dias. A presença de células ciliadas e caliciformes foi demonstrada pelo ensaio de imunofluorescência do marcador de cílios acetilado α-Tubulina (verde; Figura 3A) e o marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (vermelho; Figura 3B).

Discussion

A DPOC é uma doença inflamatória crônica comum das vias aéreas. A exposição à fumaça do tabaco leva à inflamação crônica das vias aéreas, remodelação das vias aéreas e destruição estrutural pulmonar, que é o resultado da interação de várias células estruturais e células imunes10. Como linha de frente do sistema imunológico inato no pulmão, as células epiteliais das vias aéreas desempenham um papel muito importante durante o desenvolvimento da doença1.......

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82090013).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicillin/Streptomycin solutionGibco15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, SterileBIOFILTCS016012
40 µm Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin SolutionGibcoR01510
acetylated α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
Animal Component Free Cell Dissociation KitStemcell05426
Anti-pan Cytokeratin antibodyabcamab7753
CigaretteMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigmaDN25
Ham’s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Solution Stemcell07980
Hydrocortisone Stock SolutionStemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basal Medium
Stemcell05002 
PneumaCult-ALI 10x SupplementStemcell05003 
PneumaCult-ALI Maintenance SupplementStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basal MediumStemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rat tail collagenCorning354236
Trypan BlueStemcell07050 

References

  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I.

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