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Abbiamo utilizzato la colorazione della proliferazione cellulare per identificare le cellule quiescenti nel modello di leucemia linfoblastica acuta T di zebrafish. La colorazione viene trattenuta nelle cellule non in divisione e ridotta durante la proliferazione cellulare, consentendo la selezione delle cellule dormienti per ulteriori interrogatori. Questo protocollo fornisce uno strumento funzionale allo studio dell'autorinnovamento nel contesto della quiescenza cellulare.
La quiescenza cellulare è uno stato di arresto della crescita o di proliferazione rallentata descritto nelle cellule staminali normali e tumorali (CSC). La quiescenza può proteggere le CSC dai farmaci chemioterapici antiproliferativi. Nei modelli murini di xenotrapianto di pazienti derivati da pazienti con leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL), le cellule quiescenti sono associate alla resistenza al trattamento e alla staminalità. I coloranti per la proliferazione cellulare sono strumenti popolari per il monitoraggio della divisione cellulare. Il colorante fluorescente è ancorato in modo covalente in gruppi amminici sulla membrana e sulle macromolecole all'interno della cellula. Ciò consente il tracciamento delle cellule marcate per un massimo di 10 divisioni, che possono essere risolte mediante citometria a flusso.
In definitiva, le cellule con i più alti tassi di proliferazione avranno una bassa ritenzione del colorante, poiché verrà diluito ad ogni divisione cellulare, mentre le cellule dormienti, che si dividono più lentamente, avranno la ritenzione più alta. L'uso di coloranti di proliferazione cellulare per isolare le cellule dormienti è stato ottimizzato e descritto in modelli murini T-ALL. Complementare ai modelli murini esistenti, il modello T-ALL di zebrafish derivato da rag2:Myc offre un'eccellente sede per interrogare l'autorinnovamento nella T-ALL grazie all'alta frequenza di cellule staminali leucemiche (LSC) e alla convenienza del zebrafish per esperimenti di trapianto su larga scala.
Qui, descriviamo il flusso di lavoro per la colorazione delle cellule T-ALL di zebrafish con un colorante di proliferazione cellulare, l'ottimizzazione della concentrazione del colorante per le cellule di zebrafish, il passaggio di cellule colorate con successo in vivo e la raccolta di cellule con vari livelli di ritenzione del colorante mediante selezione di cellule vive da animali trapiantati. Data l'assenza di produttori di superfici cellulari ben consolidati per le LSC nella T-ALL, questo approccio fornisce un mezzo funzionale per interrogare le cellule quiescenti in vivo. Per ottenere risultati rappresentativi, descriviamo l'efficienza di attecchimento e la frequenza LSC delle cellule ad alta e bassa ritenzione del colorante. Questo metodo può aiutare a studiare ulteriori proprietà delle cellule quiescenti, tra cui la risposta ai farmaci, i profili trascrizionali e la morfologia.
Le cellule staminali adulte sono responsabili della rigenerazione di tipi cellulari differenziati in un dato organo e sono prevalentemente presenti in uno stato dormiente, non in divisione 1,2. Ad esempio, le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che mantengono il sangue, rimangono in gran parte quiescenti e solo una piccola frazione entra nel ciclo cellulare per autorinnovarsi o differenziarsi per generare componenti del sangue maturo3. Allo stesso modo, nei tumori, una rara sottopopolazione di cellule chiamate cellule staminali tumorali (CSCs) possiede la capacità di auto-rinnovamento e sono responsabili del mantenimento a lungo termine della malignità4. Le cellule staminali tumorali esistono in vivo in uno stato di quiescenza o di crescita lenta, che può consentire loro di sfuggire ai trattamenti anti-proliferativi contro il cancro5, eludere l'eliminazione da parte del sistema immunitario6, ridurre lo stress ossidativo e migliorare le loro vie di riparazione del DNA7. Anche un basso numero di CSC rimaste dopo il trattamento può potenzialmente ripopolare il tumore, provocando una recidiva del paziente8. Di conseguenza, la comprensione della quiescenza cellulare è molto promettente per l'identificazione di potenziali vulnerabilità delle CSC e lo sviluppo di nuovi modi per colpirle.
I coloranti per la proliferazione cellulare, come la colorazione carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) e i suoi derivati, sono comunemente usati per monitorare la frequenza delle divisioni cellulari9. Il colorante permea attraverso la membrana cellulare e, una volta all'interno della cellula, subisce l'attivazione da parte delle esterasi intracellulari in un prodotto fluorescente. Il composto fluorescente risultante viene trattenuto all'interno della cellula attraverso i legami ammidici covalenti formati tra la porzione succinimidilica e i gruppi funzionali amminici delle proteine intracellulari10. Ad ogni divisione cellulare, il composto fluorescente viene diviso equamente tra le due cellule risultanti, causando una doppia diluizione del segnale. Questo colorante consente di rilevare fino a 10 divisioni cellulari attraverso l'analisi della citometria a flusso11.
Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per arricchire le popolazioni di CSC in vitro identificando popolazioni di cellule a ciclo lento con elevata ritenzione del colorante11,12. Nella T-ALL, CFSE è stata utilizzata per monitorare la crescita tumorale in vivo in xenotrapianti derivati da pazienti nei topi. Dopo la marcatura delle cellule e tre settimane di trapianto, l'analisi della citometria a flusso ha mostrato una rara popolazione di cellule che conservavano ancora la fluorescenza CFSE. Questa popolazione era associata a staminalità, resistenza al trattamento ed elevata somiglianza con le cellule che causano recidiva nei pazienti13. Di conseguenza, questo colorante fornisce uno strumento utile per lo studio dei fenotipi delle cellule staminali leucemiche (LSC) nella T-ALL.
Lo scopo del lavoro è quello di estendere l'applicazione del colorante di proliferazione cellulare per studiare la quiescenza in vivo utilizzando un modello T-ALL di zebrafish. In particolare, il modelloT-ALL 14 di zebrafish guidato da rag2:Myc fornisce un luogo eccellente per lo studio dell'auto-rinnovamento dovuto all'alta frequenza di LSC rispetto ai modelli murini e alle malattie umane15. Inoltre, l'uso del pesce zebra consente studi di trapianto su larga scala, che possono essere eseguiti a un costo di cura e manutenzione molto inferiore rispetto alle loro controparti topoche16. I pesci zebra sono eccellenti anche per le applicazioni di imaging dal vivo, poiché le cellule tumorali marcate in fluorescenza possono essere facilmente visualizzate utilizzando un semplice microscopio a fluorescenza per stimare il tasso di sviluppo del tumore16.
In questo protocollo, descriviamo il flusso di lavoro per la colorazione delle cellule T-ALL di zebrafish con colorante di proliferazione cellulare seguito dalla propagazione in vivo delle cellule colorate in zebrafish CG1 singenico. Dopo lo sviluppo della leucemia, descriviamo lo smistamento delle cellule che hanno conservato il colorante e il loro utilizzo per un successivo esperimento di trapianto di diluizione limitante per quantificare i tassi di auto-rinnovamento di LSC. Questo protocollo può essere esteso per ulteriori applicazioni, tra cui lo screening farmacologico in vivo di potenziali composti per il targeting di LSC quiescenti. Inoltre, le cellule raccolte possono essere utilizzate per diverse analisi a valle, come la profilazione trascrittomica, la proteomica e la metabolomica, offrendo informazioni uniche sul comportamento delle LSC quiescenti nella T-ALL.
In questo protocollo, stiamo utilizzando cellule T-ALL di pesce zebra marcate con GFP che sono state generate in precedenza nel ceppo CG1 e quindi possono essere iniettate direttamente nel pesce zebra CG1 singeneico ricevente15. In breve, la leucemia è stata generata mediante microiniezione di DNA di rag2:Myc e rag2:GFP in embrioni di zebrafish CG1 a cellula singola. Gli animali sono stati monitorati per lo sviluppo della leucemia a partire da 3 settimane dopo l'iniezione, utilizzando la microscopia a fluorescenza. Le cellule leucemiche GFP-positive sono state isolate FACS e trapiantate in serie in zebrafish CG1 ricevente per generare cloni con un'alta frequenza di LSC. I dettagli dell'intero protocollo sono descritti da Blackburn et al.15.
In alternativa, la T-ALL primaria derivata da rag2:Myc può essere generata mediante microiniezione di DNA di embrioni di zebrafish17. La microiniezione di DNA di rag2:Myc con un reporter fluorescente guidato da rag2 come la GFP può portare allo sviluppo di cellule B, cellule T e ALL18 miscelate. I cloni leucemici utilizzati in questo protocollo sono stati precedentemente verificati come T-ALL15. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono il pesce zebra sono state esaminate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Kentucky, protocollo 2019-3399.
1. Propagazione delle cellule T-ALL di zebrafish in vivo
2. Raccolta di cellule leucemiche marcate in fluorescenza
3. Ottimizzazione della concentrazione del colorante di proliferazione cellulare (CellTrace Far Red) per la colorazione e la vitalità cellulare del pesce zebra
NOTA: Per questo protocollo, e poiché le cellule tumorali sono marcate con GFP, abbiamo utilizzato un colorante di proliferazione delle cellule rosse lontane (CellTrace Far Red) per evitare la sovrapposizione spettrale, che verrà indicato come CT-FR.
4. Propagazione in vivo di cellule di pesce zebra T-ALL colorate con CT-FR
5. Preparazione per lo smistamento di cellule T-ALL di pesce zebra colorate con CT-FR
6. Smistamento
NOTA: Tenere tutte le provette e la piastra donatrice sul ghiaccio per tutto il tempo, tranne quando vengono utilizzate per lo smistamento.
7. Trapianto di cellule selezionate alla diluizione limitante e monitoraggio dell'insorgenza del tumore
8. Determinazione della frequenza delle cellule staminali leucemiche
Figura 1: Flusso di lavoro per l'uso della colorazione di tracciamento cellulare per isolare le cellule quiescenti nel modello T-ALL del pesce zebra. Illustrazione schematica della colorazione delle cellule T-ALL di zebrafish con la colorazione di proliferazione cellulare, la propagazione in un zebrafish CG1 (pannello superiore) e l'ordinamento delle cellule in base alla ritenzione della colorazione di proliferazione cellulare (pannello centrale). Le cellule raccolte sono state utilizzate per un saggio di diluizione limitante per determinare la frequenza delle LSC (pannello inferiore). Abbreviazioni: T-ALL = leucemia linfoblastica acuta a cellule T; LSCs = cellule staminali leucemiche; CT-FR = CellTrace Lontano Rosso; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PE = ficoeritrina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo seguito il protocollo sopra descritto per selezionare le cellule che hanno trattenuto il colorante di proliferazione cellulare, CT-FR, e le abbiamo utilizzate per un saggio di diluizione limitante (LDA) per stimare la frequenza di LSC nelle popolazioni CT-FR High e CT-FR Low. Per impostare il gating per l'esperimento di citometria a flusso, abbiamo utilizzato un controllo senza fluoroforo (senza colore) oltre ai controlli a colore singolo (Figura 2A
Le LSC sono note per essere resistenti ai trattamenti chemioterapici convenzionali e antiproliferativi e trovare terapie mirate contro queste cellule è molto promettente per ridurre l'insorgenza di recidive e migliorare la prognosi dei pazienti20. Ricerche precedenti hanno descritto l'uso di coloranti fluorescenti di proliferazione cellulare per identificare una piccola popolazione di cellule quiescenti associate alla resistenza ai farmaci e alla staminalità nei...
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dal National Cancer Institute (R37CA227656 to JSB). Questa ricerca è stata supportata anche dalla citometria a flusso e dal monitoraggio immunitario delle risorse condivise del Markey Cancer Center (P30CA177558 dell'Università del Kentucky.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
26 G/2” micro-syringe | Hamilton | 87930 | NA |
35 µm filter cap FACS tubes | Falcon | 352235 | NA |
40 µm cell strainer | CELLTREAT | 229482 | NA |
96-well skirted PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
Cell sorter | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
Conical tubes | VWR | 10026-078 | NA |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
Epifluorescence stereo microscope | Nikon | SMZ25 | NA |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
Fish system water | N/A | N/A | 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate, an anesthetic |
Petri dishes | Corning | 07-202-011 | NA |
Razor blades | American Line | 66-0089 | NA |
Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |
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