Identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare

Riepilogo

Abbiamo utilizzato la colorazione della proliferazione cellulare per identificare le cellule quiescenti nel modello di leucemia linfoblastica acuta T di zebrafish. La colorazione viene trattenuta nelle cellule non in divisione e ridotta durante la proliferazione cellulare, consentendo la selezione delle cellule dormienti per ulteriori interrogatori. Questo protocollo fornisce uno strumento funzionale allo studio dell'autorinnovamento nel contesto della quiescenza cellulare.

Abstract

La quiescenza cellulare è uno stato di arresto della crescita o di proliferazione rallentata descritto nelle cellule staminali normali e tumorali (CSC). La quiescenza può proteggere le CSC dai farmaci chemioterapici antiproliferativi. Nei modelli murini di xenotrapianto di pazienti derivati da pazienti con leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL), le cellule quiescenti sono associate alla resistenza al trattamento e alla staminalità. I coloranti per la proliferazione cellulare sono strumenti popolari per il monitoraggio della divisione cellulare. Il colorante fluorescente è ancorato in modo covalente in gruppi amminici sulla membrana e sulle macromolecole all'interno della cellula. Ciò consente il tracciamento delle cellule marcate per un massimo di 10 divisioni, che possono essere risolte mediante citometria a flusso.

In definitiva, le cellule con i più alti tassi di proliferazione avranno una bassa ritenzione del colorante, poiché verrà diluito ad ogni divisione cellulare, mentre le cellule dormienti, che si dividono più lentamente, avranno la ritenzione più alta. L'uso di coloranti di proliferazione cellulare per isolare le cellule dormienti è stato ottimizzato e descritto in modelli murini T-ALL. Complementare ai modelli murini esistenti, il modello T-ALL di zebrafish derivato da rag2:Myc offre un'eccellente sede per interrogare l'autorinnovamento nella T-ALL grazie all'alta frequenza di cellule staminali leucemiche (LSC) e alla convenienza del zebrafish per esperimenti di trapianto su larga scala.

Qui, descriviamo il flusso di lavoro per la colorazione delle cellule T-ALL di zebrafish con un colorante di proliferazione cellulare, l'ottimizzazione della concentrazione del colorante per le cellule di zebrafish, il passaggio di cellule colorate con successo in vivo e la raccolta di cellule con vari livelli di ritenzione del colorante mediante selezione di cellule vive da animali trapiantati. Data l'assenza di produttori di superfici cellulari ben consolidati per le LSC nella T-ALL, questo approccio fornisce un mezzo funzionale per interrogare le cellule quiescenti in vivo. Per ottenere risultati rappresentativi, descriviamo l'efficienza di attecchimento e la frequenza LSC delle cellule ad alta e bassa ritenzione del colorante. Questo metodo può aiutare a studiare ulteriori proprietà delle cellule quiescenti, tra cui la risposta ai farmaci, i profili trascrizionali e la morfologia.

Introduzione

Le cellule staminali adulte sono responsabili della rigenerazione di tipi cellulari differenziati in un dato organo e sono prevalentemente presenti in uno stato dormiente, non in divisione ^1,2. Ad esempio, le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che mantengono il sangue, rimangono in gran parte quiescenti e solo una piccola frazione entra nel ciclo cellulare per autorinnovarsi o differenziarsi per generare componenti del sangue maturo³. Allo stesso modo, nei tumori, una rara sottopopolazione di cellule chiamate cellule staminali tumorali (CSCs) possi....

Protocollo

In questo protocollo, stiamo utilizzando cellule T-ALL di pesce zebra marcate con GFP che sono state generate in precedenza nel ceppo CG1 e quindi possono essere iniettate direttamente nel pesce zebra CG1 singeneico ricevente¹⁵. In breve, la leucemia è stata generata mediante microiniezione di DNA di rag2:Myc e rag2:GFP in embrioni di zebrafish CG1 a cellula singola. Gli animali sono stati monitorati per lo sviluppo della leucemia a partire da 3 settimane dopo l'iniezione, utilizzando la microscopia a fluorescenza. Le cellule leucemiche GFP-positive sono state isolate FACS e trapiantate in ser....

Risultati

Abbiamo seguito il protocollo sopra descritto per selezionare le cellule che hanno trattenuto il colorante di proliferazione cellulare, CT-FR, e le abbiamo utilizzate per un saggio di diluizione limitante (LDA) per stimare la frequenza di LSC nelle popolazioni CT-FR High e CT-FR Low. Per impostare il gating per l'esperimento di citometria a flusso, abbiamo utilizzato un controllo senza fluoroforo (senza colore) oltre ai controlli a colore singolo (Figura 2A

Discussione

Le LSC sono note per essere resistenti ai trattamenti chemioterapici convenzionali e antiproliferativi e trovare terapie mirate contro queste cellule è molto promettente per ridurre l'insorgenza di recidive e migliorare la prognosi dei pazienti²⁰. Ricerche precedenti hanno descritto l'uso di coloranti fluorescenti di proliferazione cellulare per identificare una piccola popolazione di cellule quiescenti associate alla resistenza ai farmaci e alla staminalità nei.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA