Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

Résumé

Nous avons synthétisé et caractérisé un substrat à base de gélatine accordable pour la culture de cellules endothéliales vasculaires (CE) dans des conditions de flux vasculaire pertinentes. Cette surface biomimétique reproduit à la fois des conditions physiologiques et pathologiques, permettant d’étudier les forces mécaniques sur le comportement des CE et de faire progresser notre compréhension de la santé vasculaire et des mécanismes de la maladie.

Résumé

Nous présentons un modèle in vitro innovant visant à étudier les effets combinés de la rigidité tissulaire et du stress de cisaillement sur la fonction des cellules endothéliales (CE), qui sont cruciales pour comprendre la santé vasculaire et l’apparition de maladies telles que l’athérosclérose. Traditionnellement, les études ont exploré les impacts de la contrainte de cisaillement et de la rigidité du substrat sur les CE, indépendamment. Cependant, ce système intégré combine ces facteurs pour fournir une simulation plus précise de l’environnement mécanique du système vasculaire. L’objectif est d’examiner la mécanotransduction des EC à travers divers niveaux de rigidité tissulaire et conditions d’écoulement à l’aide de CE humaines. Nous détaillons le protocole de synthèse d’hydrogels de méthacrylate de gélatine (GelMA) à rigidité réglable et leur ensemencement avec des EC pour obtenir une confluence. De plus, nous décrivons la conception et l’assemblage d’une chambre d’écoulement rentable, complétée par des simulations numériques de dynamique des fluides, pour générer des conditions d’écoulement physiologiques caractérisées par un écoulement laminaire et des niveaux de contrainte de cisaillement appropriés. Le protocole intègre également le marquage par fluorescence pour la microscopie confocale, ce qui permet d’évaluer les réponses EC à la fois à la compliance tissulaire et aux conditions d’écoulement. En soumettant des CE cultivées à de multiples stimuli mécaniques intégrés, ce modèle permet des études complètes sur la façon dont des facteurs tels que l’hypertension et le vieillissement peuvent affecter la fonction des CE et les maladies vasculaires médiées par les CE. Les connaissances acquises grâce à ces recherches seront déterminantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux maladies vasculaires et pour développer des stratégies de traitement efficaces.

Introduction

L’endothélium, qui tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins, joue un rôle central dans le maintien de la santé vasculaire. Les cellules endothéliales (CE) sont essentielles à la régulation de diverses fonctions cardiovasculaires, notamment le contrôle du tonus des vaisseaux, la perméabilité sélective, l’hémostase et la mécanotransduction ^1,2. La recherche a fermement lié le dysfonctionnement de la CE à un rôle primordial dans le développement de l’athérosclérose. Notamment, les CE rencontrent diverses forces mécaniques aux interfaces où elles interagissent avec le flux sanguin et les tissus vasculaire....

Protocole

1. Synthèse de GelMA

1. Préparez une solution 0,2 M de carbonate de sodium anhydre et une solution 0,2 M de bicarbonate de sodium.
2. Mélanger 46 mL de solution de bicarbonate de sodium avec 15 mL de solution de carbonate de sodium et ajouter 139 mL d’eau désionisée (DI). Ajustez le pH à 9,5 en utilisant 0,1 M de NaOH et de HCl si nécessaire.
3. Ajouter 10 g de gélatine de type A, à 300 blooms de peau de porc à 100 mL de tampon carbonate-bicarbonate à une concentration de 10 % p/v.
4. Dissoudre la gélatine à l’aide d’un bain-marie à 55 °C en agitant la solution à 700 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois compl....

Résultats

La figure 1 représente le dispositif expérimental, décrivant le processus de synthèse de GelMA par une réaction de méthacrylation. Le produit résultant a ensuite été utilisé pour fabriquer le substrat d’hydrogel, sur lequel les CE ont été ensemencés. Par la suite, les cellules ont été introduites dans la chambre d’écoulement pour une expérience d’écoulement de 6 h à 12 dyne/cm².

¹La spectroscopie RMN H a été utilis?.......

Discussion

Le système vasculaire est un environnement dynamique où diverses forces influencent considérablement le comportement cellulaire. Il serait inexact d’étudier les événements biologiques dans les maladies cardiovasculaires sans tenir compte de ces forces. Ainsi, les modèles cellulaires capables d’émuler l’environnement mécanique vasculaire sont cruciaux. Les chercheurs ont déjà fait des progrès significatifs dans la mise en évidence de l’effet de ces forces sur le comportement cellulaire

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunostaining
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabrication
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC growth kit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Cell Culture
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylic Anhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	14080-055	General
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Sodium Carbonate	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture