用于加载和递送外泌体的微针贴片的制造和表征

Summary

外泌体具有显著的临床潜力， 但由于体内易 清除且稳定性差，其实际应用受到限制。微针提供了一种解决方案，通过刺穿生理屏障和干态保存来实现局部递送，从而解决了外泌体给药的局限性并扩大了其临床应用。

Abstract

外泌体作为新兴的“下一代”生物治疗药物和药物递送载体，在从药物递送和再生医学到疾病诊断和肿瘤免疫治疗等多个生物医学领域具有巨大潜力。然而，传统推注的快速清除和外泌体的稳定性差限制了其临床应用。微针作为一种溶液，可延长外泌体在给药部位的停留时间，从而维持药物浓度并促进持续的治疗效果。此外，微针还具有维持生物活性物质稳定性的能力。因此，我们介绍了一种用于加载和递送外泌体的微针贴片，并分享了包括外泌体分离、制造和表征外泌体负载的微针贴片的方法。以海藻糖和透明质酸为尖端材料，聚乙烯吡咯烷酮为基材，通过两步铸造法制备微针贴片。微针表现出强大的机械强度，尖端能够承受 2 N。猪皮用于模拟人体皮肤，微针尖端在皮肤穿刺后 60 秒内完全熔化。从微针释放的外泌体表现出与新鲜外泌体相当的形态、粒径、标志蛋白和生物学功能，使树突状细胞能够摄取并促进其成熟。

Introduction

外泌体是细胞释放到细胞外基质中的小囊泡，已被提议作为治疗多种疾病和癌症的潜在生物治疗药物和药物递送载体¹。在其生物发生过程中，外泌体封装了细胞内的各种生物活性分子，包括功能性蛋白和核酸²。因此，当外泌体在运输过程中被受体细胞吸收时，外泌体具有调节靶细胞中基因表达和细胞功能的能力³。作为一种天然信息信使，外泌体在组织再生、免疫调节和作为递送载体中得到了充分利用⁴。通过工程技术，可以在外泌体表面富集特异性配体，从而能够诱导或抑制受体细胞中的信号转导事件或靶向特定细胞类型⁵。化疗剂也可以加载到外泌体中用于癌症治疗⁶。此外，外泌体能够穿过血脑屏障进行治疗性货物递送，使其在治疗脑部疾病方面非常有前途⁷。与脂质体相比，外泌体表现出增强的细胞摄取和更好的生物相容性⁸。它们能够有效地进入其他细胞，同时表现出更好的耐受性和更低的毒性⁹。然而，传统的外泌体推注容易被血流中的肝脏、肾脏和脾脏隔离和快速清除¹⁰。此外，外泌体 在体外 稳定性差，易受储存条件的影响，这....

Protocol

这项研究不需要道德审查，因为用于第 3 节中描述的实验的猪皮是从市场上作为可食用的猪耳朵购买的，而不是来自实验动物。

1. 外泌体的分离

1. 细胞培养
   1. 在直径为 15 cm 的培养皿中，在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素溶液 （100×） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 培养基中培养小鼠卵巢上皮癌细胞 ID8（参见 材料表）。
   2. .......

Discussion

目前，分离外泌体的主要方法包括超速离心、密度梯度离心、超滤、沉淀、免疫亲和磁珠和微流控²⁴。由于微针尖端空间小导致负载能力有限，因此需要增加外泌体的浓度以加载更多。因此，我们选择超滤浓缩细胞培养上清液，然后用超速离心分离外泌体。通过少量液体重悬来增加外泌体的浓度，以便微针可以加载数十至数百微克的外泌体。然而，这种方法导致分离的外泌体溶?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x penicillin-streptomycin solutions	Jrunbio Scientific	MA0110	Cell culture
180 kDa pre-stained protein marker	Thermo	26616	Western blotting
3% Uranyl acetate	Henan Ruixin Experimental Supplies	GZ02625	Morphological characterization of exosomes
3D printer	BMF technology	nanoArch S130	Mold preparation
4%–20% precast gel	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	Western blotting
5× SDS-PAGE loading buffer	Titan	04048254	Western blotting
Anti-mouse Alix antibody	Biolegend	12422-1-AP	Western blotting
Anti-mouse CD63 antibody	Biolegend	ab217345	Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibody	Biolegend	104713	Antibody
Auto fine coater	ZIZHU	JBA5-100	Morphological characterization of microneedle
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Centrifuge	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	Cell centrifuge
Circulating water vacuum pump	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	Filtration
CO2 incubator	Eppendorf	CellXpert C170	Cell culture
Confocal laser scanning microscope	Nikon	A1HD25	Fluorescence imaging
Copper mesh	Beijing Zhongjingkeyi Technology	JF-ZJKY/300	Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrate	Aladdin	5138-23-4	Fabrication of microneedle
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Meilunbio	MA0212	Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered saline	Meilunbio	MA0010	Cell culture
Electrophoresis system	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blotting
Fetal bovine serum	Jrunbio Scientific	JR100	Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibody	Biolegend	117305	Antibody
Flow cytometry	BD	LSR Fortessa	Fluorescence detection
Gel imager	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	CST	7074S	Western blotting
HTL resin	BMF technology		Mold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	Fabrication of microneedle
Immersion oil	Nikon	MXA22168	Fluorescence imaging
Ion cleaner	JEOL	EC-52000IC	Morphological characterization of exosomes
Microscope	Olympus	CKX53	Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8	MeisenCTCC	CC90105	Cell culture
Nanoparticle tracking analysis	Particle Metrix	ZetaView	Size analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend	107619	Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime	ST507	Protease inhibitors
Plasma cleaner	Hefei Kejing Material Technology	PDC-36G	Fabrication of microneedle
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	9016-00-6	Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)	Aladdin	9003-39-8	Fabrication of microneedle
Prism	GraphPad	Version 9	Statistical analysis
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western blotting
Quick-snap centrifuge	Beckman	344619	Exosomes extraction
RIPA lysis buffer	Applygen	C1053	Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640	Meilunbio	MA0548	Cell culture
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-IT800	Morphological characterization of microneedle
Stereo microscope	Olympus	SZX16	Characterization of morphology
Super ECL detection reagent	Applygen	P1030	Western blotting
Tensile meter	Instron	68SC-05	Mechanical testing
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-2100plus	Morphological characterization of exosomes
Tris buffered saline	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	Western blotting
Tween-20	Beyotime	ST825	Western blotting
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosomes extraction
Ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096	Exosomes concentration
Vacuum drying oven	Shanghai Yiheng Technology	DZF-6024	Fabrication of microneedle
Vacuum filtration system	Biosharp	BS-500-XT	Filtration