Количественная оценка аденоассоциированных вирусных геномов в очищенных образцах векторов методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции

Summary

Точное количественное определение копий векторного генома аденоассоциированного вируса (AAV) имеет решающее значение, но стандартизированный протокол еще не разработан. В этом протоколе описан валидированный метод подготовки очищенных образцов AAV и проведения цифровой капельной полимеразной цепной реакции (dd_PCR) для надежного количественного определения титра вирусного генома.

Abstract

Аденоассоциированный вирус (AAV) является непатогенным вирусом, используемым в качестве средства доставки для передачи терапевтических генов пациентам. Точное количественное определение числа копий генома AAV в векторных препаратах имеет важное значение для оптимизации биопроцессов и расчета дозировки как в доклинических, так и в клинических исследованиях продуктов генной терапии на основе AAV. В настоящее время отсутствует консенсусный протокол для титрования вирусного генома AAV. В данной работе мы представляем протокол цифровой капельной ПЦР (dd_PCR) для количественной оценки вирусных геномов в очищенных векторных образцах. Образцы обрабатывают ДНКазой I для удаления неупакованной загрязняющей ДНК. Затем обработанные ДНКазой образцы смешиваются с соответствующим набором праймер-зондов (разработанным в соответствии с целевым геномом AAV) и реагентами ПЦР, а затем загружаются в генератор капель. Подготовленные капли переносят в ПЦР-планшет, где проводят ПЦР-амплификацию и анализ. Титр вирусного генома рассчитывается на основе концентрации (копий/мкл) с учетом разведений образца. Успешное измерение показывает четкое разделение положительных и отрицательных капельных облаков, имеет не менее 10 000 принятых капель, показывает значение от 10 копий/мкл до 10 000 копий/мкл и имеет коэффициент вариации (CV) между повторами менее 20%. Надежное титрование вирусного генома поможет в разработке безопасных и эффективных продуктов генной терапии на основе AAV.

Introduction

Генная терапия — это терапевтический метод, обычно используемый для лечения генетических заболеваний. Дизайн любой конкретной генной терапии специфичен для ассоциированной патологии целевого показания, но все генные терапии включают внутриклеточную доставку генетического материала к клеткам-мишеням с целью достижения терапевтического^{эффекта.} Генную терапию можно разделить на несколько категорий, включая замену генов при мутациях, приводящих к потере функции, подавление экспрессии генов при аномалиях усиления функции и методы редактирования генов. Независимо от конкретной используемой стратегии, терапевтический материал нуклеиновой кислоты (называемый трансгеном) должен быть упакован в вектор для достижения целенаправленной внутриклеточной доставки^.

Несмотря на то, что для разработки генной терапии доступно множество вирусных и невирусных векторных систем, аденоассоциированные вирусы (AAV) часто выбирают из-за широкого вирусного тропизма и низкой иммуногенности, связанных с этой группой ^{вирусов.} На сегодняшний день семь методов генной терапии, использующих AAV для терапевтической доставки генов, получили одобрение Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) или Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA^{) и} нацелены на заболевания, варьирующиеся от гемофилии (например, Roctavian) до спинальной мышечной атрофии (например, Zolgensma).

Производство генной терапии на основе AAV проистекает из понимания самого AAV дикого типа. AAV — это небольшой ДНК-вирус из семейства Parvoviridae, включающий 13 основных серотипов (AAV1-13)³. Геном AAV состоит из одноцепочечной молекулы ДНК размером ~4,7 kb, содержащей две основные открытые рамки считывания (ORF), которые кодируют основные вирусные гены, необходимые для репликации генома, сборки капсида и упаковки (rep, cap). Вирусный геном фланкирован как на 5', так и на 3'-концах палиндромными нуклеотидными последовательностями, называемыми инвертированными концевыми повторами (ITR). Эти ITR образуют шпилькообразные структуры, которые играют решающую роль в репликации генома и упаковке вирусных геномов de novo во вновь синтезированные вирусные капсиды. AAV является хелпер-зависимым вирусом и, следовательно, требует экспрессии вспомогательных генов других вирусов, таких как вирус простого герпеса (ВПГ) или аденовирус (AdV), чтобы стать компетентным в репликации¹.

Для получения AAV используют подходящую клеточную систему экспрессии, способствующую экспрессии вирусных белков капсида и последующей сборке в вирусные частицы de novo, с последующей инкапсуляцией выбранного трансгена с ITR-флангом (также называемого векторным геномом). В этом способе обычно используется тройная плазмидная система, содержащая (1) плазмиду, содержащую хелперные гены, полученные от вируса-хелпера, (2) плазмиду, кодирующую основные вирусные элементы (rep/cap), и (3) плазмиду, несущую кассету терапевтической экспрессии (обычно называемую транспортной плазмидой)⁴. Уникальное присутствие сигналов упаковки с инвертированным концевым повтором (ITR), фланкирующих кассету терапевтической экспрессии в транспортной плазмиде, обеспечивает специфическую упаковку трансгена, в то время как вирусные гены, присутствующие на других плазмидах, в основном исключаются. Котрансфекция этой трехплазмидной системы в клеточную платформу экспрессии (обычно HEK293T клеток) приводит к получению трансдукционно-компетентных вирусных частиц с дефицитом репликации, пригодных для использования в генной терапии ^3,4.

Существует ряд критических характеристик качества (CQA), связанных с производством генной терапии на основе AAV, которые должны быть оценены для обеспечения эффективности, чистоты и безопасности предполагаемого лекарственного препарата⁴. Эти CQA включают титр вируса, содержание капсида и агрегацию. Титр вируса сам по себе представляет собой комбинацию количества вирусных частиц (титра капсида) и количества векторных геномов (титров векторного генома), присутствующих в любом данном препарате. В идеале соотношение между этими двумя титрами должно быть 1:1, поскольку каждая вирусная частица должна содержать один векторный геном, но неэффективность упаковки векторного генома во время биосинтеза приводит к совместному производству пустых или частично заполненных капсид (содержащих частичные векторные последовательности генома и/или невекторные последовательности генома)⁵. Присутствие таких примесей потенциально может вызывать необоснованные иммунные реакции и конкурировать за сайты связывания переносчиков, тем самым увеличивая риск иммунотоксичности и снижая скорость трансдукции полных^{капсидов6}. Таким образом, точное количественное определение геномов AAV имеет важное значение для установления титра вируса и содержания капсида. Это влияет как на фундаментальные исследования, так и на индустрию генной терапии, которая требует точной дозировки для поддержания безопасности и эффективности лекарственных препаратов.

Цифровая капельная полимеразная цепная реакция (dd_PCR) стала тесно связана с количественной оценкой титра вируса, поскольку ее можно использовать для определения количества векторных геномов, присутствующих в^{любом конкретном} препарате. Сама цифровая ПЦР была впервые представлена в 1990-х годах ^8,9 и dd_PCR является усовершенствованием этой технологии, позволяющим осуществлять высокопроизводительную обработку образцов^10,11. В dd_PCR ПЦР-реакция объемом 20 мкл в реальном времени разбивается примерно на 20 000 капель в масляной оболочке, что дает до 96 таких реакций при размещении на стандартном 96-луночном планшете. По сравнению с обычной количественной ПЦР (кПЦР), dd_PCR имеет ряд преимуществ, включая повышенную чувствительность, повышенную точность и более прямое и абсолютное количественное определение целевых последовательностей без необходимости использования стандартных кривых. Кроме того, высокий уровень секционирования в dd_PCR снижает влияние ингибиторов ПЦР и сводит к минимуму вероятность смещения от преимущественной амплификации определенных шаблонов, что делает его привлекательным вариантом для аналитического измерения титрования векторного генома.

Protocol

Описанный здесь протокол предназначен для количественной оценки титра вирусного генома очищенного, собственного производства вектора AAV9 с зеленым флуоресцентным белком (GFP) в качестве трансгена¹² с высокой точностью (Таблица 1). Тем не менее, этот протокол применим к любому серотипу AAV и любому дизайну векторного генома, при условии, что наборы праймеров/зондов предназначены для нацеливания на конкретный векторный геном, представляющий интерес. Подробная информация о реагентах, праймерах, зондах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление исходных растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте все исходные растворы, необходимые для разведения образца, на рабочей станции ПЦР, чтобы избежать загрязнения чужеродной ДНК.

1. Приготовьте 10-кратный буфер для ПЦР-анализа, который состоит из 500 мМ KCl, 100 мМ Tris-HCl, 15 мМ MgCl₂ и 0,01 % (w/v) BSA. Измерьте pH раствора и отрегулируйте его до 8,3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре до 1 месяца.
2. Приготовьте буфер для разведения AAV, который состоит из 1x буфера для ПЦР-анализа, 0,2 нг/мкл ДНК спермы лосося (sss) и 0,1 % плуронового F-68. Готовьте этот раствор свежим при каждом анализе и поддерживайте его при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если плуроновый F-68 недоступен, можно использовать альтернативу, такую как неионогенное поверхностно-активное вещество Poloxamer 188.

2. Подготовка образцов - обработка ДНКазой I и серийное разведение

ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления загрязнителей ДНК, которые могут снизить точность титрования векторного генома, свободная ДНК, присутствующая в образце AAV (включая оставшуюся плазмидную ДНК или неинкапсулированные вирусные геномы), может быть удалена перед амплификацией ПЦР с использованием ДНКазы. Это возможно, поскольку векторные геномы инкапсулированы в капсиды AAV и, следовательно, недоступны до стадии денатурации самой ПЦР-реакции (см. шаг 5). Кроме того, поскольку номер векторного генома в любом конкретном образце неизвестен, необходимо выполнить серийное разведение образцов, чтобы гарантировать, что измерения остаются в пределах верхнего и нижнего обнаруживаемых пределов. Все манипуляции с образцом выполняйте на рабочей станции ПЦР. Храните все образцы на льду, если не указано иное.

1. Смешайте выбранный для анализа образец AAV, кратковременно сделав его вихревым, а затем центрифугируя, чтобы убедиться, что вся жидкость остается на дне пробирки, содержащей образец.
2. Для обработки ДНКазой добавьте 45 мкл раствора, содержащего 1x буфер ДНКазы I, 0,1% плуроновой F-68 и 0,04 Ед/мкл ДНКазы I в воде, не содержащей ДНКазы, в 8-пробирочную полосковую пробирку ПЦР объемом 0,2 мкл.
3. Перенесите 5 мкл образца в пробирку с раствором ДНКазы. Сделайте образцы вихревыми и кратковременно центрифугируйте, чтобы убедиться, что вся жидкость остается на дне.
4. В термоамплификаторе инкубируйте образцы в течение 1 часа при 37 °C, затем охладите до 4 °C. Положите на лед как можно скорее после достижения 4 °C.
5. Используя свежую 8-пробирочную полоску для ПЦР объемом 0,2 мл, сделайте соответствующие разведения образца, обработанного ДНКазой, в буфере для разведения AAV. Рекомендуемые разведения образца зависят от ожидаемого титра vg (Таблица 2), но стремитесь как минимум к 2 различным разведениям на образец и запускайте каждое разведение в двух экземплярах. Убедитесь, что вы тщательно (2 000-3 000 об/мин) перебрасываете образцы в течение 5 секунд, прежде чем извлекать какой-либо объем.
6. После серийного разбавления пробы подвергаются вихревому охлаждению и центрифуге, чтобы убедиться, что вся жидкость остается на дне пробирок.
7. Включите положительный контроль, для которого известен титр vg, и отрицательный контроль (только буфер разбавления AAV), который также называется контролем без шаблона (NTC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положительным контролем может быть AAV собственного производства или коммерческий эталонный материал AAV, который включает в себя целевую последовательность праймеров/зонда.

3. Приготовление мастер-микса dd_PCR

Примечание: Выберите подходящую последовательность-мишень в векторном геноме и спроектируйте прямой праймер, обратный праймер и гидролизные зонды, меченные репортерными флуорофорами FAM или HEX, в соответствии с опубликованными^{рекомендациями}. Праймеры, нацеленные на трансген, являются предпочтительными по сравнению с праймерами, нацеленными на ITR, поскольку трансген специфичен для дизайна векторного генома, а вторичная структура, связанная с формированием шпильки ITR, может препятствовать эффективному связыванию праймеров. Более того, праймеры ITR могут завышать титры AAV, если частично заполненные капсиды, содержащие усеченные фрагменты векторного генома, присутствуют и все еще содержат любую из последовательностей ITR¹⁴. Приготовьте dd_PCR мастер-смесь на отдельном рабочем месте (комнате для предварительного ПЦР). Это помещение должно быть отделено от того, где готовятся образцы, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

1. Дайте грунтовке, зонду и реагентам dd_PCR супермикс нагреться до комнатной температуры (20-25 °C). После этого нанесите вихревую обработку всех реагентов и кратковременно центрифугируйте пробирки, чтобы собрать всю жидкость на дне пробирки.
2. Приготовьте объем dd_PCR мастер-смеси в отдельной микроцентрифужной пробирке в соответствии с необходимым количеством реакций, объединив прямой и обратный праймеры, зонд, dd_PCR супермикс и воду, не содержащую ДНКазы, в соответствии с объемами и концентрациями, описанными в таблице 3.
   1. Сделайте вортексом основную смесь, а затем кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы убедиться, что вся жидкость остается на дне пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда подготавливайте дополнительный dd_PCR объем основной смеси, чем требуется (n + 1), чтобы учесть потерю объема пипетирования.
3. Перелейте 19,8 мкл мастер-смеси в каждую пробирку на свежую 8-пробирочную полоску объемом 0,2 мл ПЦР.

4. Генерация капель

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы и мастер-микс смешиваются отдельно перед загрузкой dd_PCR картридж, генерирующий капли. Все манипуляции выполняйте на рабочей станции ПЦР, желательно отличной от той, где были подготовлены пробы, во избежание загрязнения ампликоном. В качестве альтернативы можно тщательно очистить рабочую станцию ПЦР после подготовки образцов.

1. Переведите 2,2 мкл разведенного образца в объем 19,8 мкл мастер-смеси dd_PCR каждую пробирку 8-пробирочной полоски для ПЦР и хорошо перемешайте. Сделайте вихревую и кратковременную центрифугирование, чтобы убедиться, что вся жидкость остается на дне.
2. Перелейте 20 мкл этого раствора в лунки, расположенные в среднем ряду «образец» картриджа, генерирующего капли. Избегайте образования пузырей в картридже, генерирующем капли; Это может привести к тому, что прибор будет выдавать ошибки, и капли не будут генерироваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку картриджи имеют 8-луночный формат, как и полоски для ПЦР-пробирок, рекомендуется использовать 8-канальную пипетку.
3. Перекачайте 60 μл каплевидного масла в лунки, расположенные в нижнем «масляном» ряду картриджа, генерирующего каплю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не оставляйте лунку картриджа, генерирующего капли, пустой; Заполните пустую лунку для образца dd_PCR буферным регулятором для зондов (с соответствующим объемом, описанным выше).
4. Наденьте резиновую прокладку на картридж, генерирующий капли, и поместите его в генератор капель.
5. После того, как капли будут сгенерированы, с помощью 8-канальной пипетки медленно переведите 42,5 мкл раствора с dd_PCR чипа на многолуночный ПЦР-планшет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте пипетку медленно и под углом 45 градусов, чтобы избежать попадания капель в жидкость во время пипетирования. Визуально осмотрите пластину, чтобы все лунки были заполнены одинаковым количеством жидкости и капли были видны в виде непрозрачного слоя в лунке.
6. Запечатайте пластину крышкой из алюминиевой фольги в термосварочной машине в течение 5 секунд при температуре 180 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально убедитесь, что все колодцы герметизированы. Если нет, повторите еще 5 с при 180 °C. Герметичная пластина может храниться до 4 часов при температуре 4 °C перед dd_PCR амплификацией в термоамплификаторе.

5. Усиление dd_PCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Термоамплификатор должен быть размещен в отдельной комнате от комнаты для предварительной ПЦР, чтобы пространственно отделить активность перед ПЦР от амплификации ПЦР и избежать ложноположительных результатов из-за загрязнения ампликоном.

1. Поместите планшет в термоамплификатор (с реакционным модулем на 96 лунок) для амплификации ПЦР и надежно закройте его.
2. Настройте амплификатор для работы в условиях, описанных в таблице 4 , и при реакционном объеме 40 μL. Включите в настройки программы этап предварительного нагрева и убедитесь, что крышка нагрета до 99 °C.
3. Когда программа ПЦР будет завершена, держите планшет при температуре 4 °C не менее 15 минут, чтобы убедиться, что планшет полностью охлажден.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластину можно хранить в течение 48-72 часов при температуре 4 °C, прежде чем капли должны быть считаны.

6. Считывание капель

1. Загрузите пластину в считыватель капель, введите следующую информацию в системное программное обеспечение и продолжите чтение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип эксперимента = Прямая количественная оценка; Supermix = dd_PCR супермикс для зондов (без dUTP); Тип анализа = одна мишень на канал; Информация о цели, сигнальный канал 1 = канал FAM или HEX-канал в зависимости от используемого зонда.
2. Аннотируйте образцы таким образом, чтобы можно было определить и эффективно идентифицировать положение каждой выборки из файла данных.

7. Анализ данных

1. Выполняйте анализ данных с помощью совместимого программного обеспечения, предоставленного производителем считывателя капель.
2. Проведите испытание на пригодность системы для оценки общей производительности (и, следовательно, надежности) анализа.
   1. Проверьте количество событий (количество капель), измеренное для каждой лунки на ПЦР-планшете. В идеале количество мероприятий должно составлять от 15 000 до 20 000. Если количество событий равно < 10 000, то это значение должно быть исключено из анализа.
   2. Оцените график 1D или 2D амплитуды и проверьте наличие капельного дождя.
   3. Перейдите на вкладку таблицы данных и экспортируйте данные в файл Excel.
3. Рассчитайте титр vg, выполнив следующие действия:
   1. Рабочий диапазон dd_PCR составляет 10-10 000 копий/мкл. Исключите из анализа любое значение, составляющее <10 копий/мкл. Рекомендуемый диапазон для используемого здесь оборудования dd_PCR составляет 25-5000 копий/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа данных предоставит номер векторного генома в соответствии с объемом ПЦР-реакции (40 μл), но при этом не учитываются коэффициенты разбавления, применяемые во время подготовки образца.
   2. Рассчитайте титр vg образца на объем (обычно выражаемый как vg/мл) с учетом различных коэффициентов разбавления в процессе подготовки образца с использованием следующего соотношения:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация (значение, полученное в результате анализа данных) x 10 (разведение ДНКазы I перед обработкой) x 10 (разведение мастер-смеси ПЦР) x 1000 (от μл до мл) выбранного разведения образца (в буфере для разведения AAV - например, Таблица 2).
   3. Рассчитайте коэффициент вариации (% CV) между репликами и между различными разведениями одного и того же образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: %CV вычисляется путем деления стандартного отклонения на среднее. Если %CV между различными разведениями составляет >20 %, то это значение не следует считать точным.
   4. Проверьте значения отрицательного и положительного контроля. Отрицательный контроль должен быть менее 5 копий/мкл.

Discussion

Точное количественное определение копий генома вектора AAV в векторных препаратах имеет важное значение для разработки продуктов генной терапии на основе AAV. Существует несколько методов определения титра vg, при этом количественная ПЦР (кПЦР) и dd_PCR являются двумя наиболее широко используемыми и принятыми методами. dd_PCR часто предпочитают количественной ПЦР из-за ее независимости от эффективности амплификации, более высокой точности и большей надежности¹⁵. В литературе имеются многочисленные протоколы титрования векторного генома методом dd_PCR, каждый из которых имеет свои методы пробоподготовки 15,16,17. Тем не менее, существует нехватка квалифицированного протокола консенсуса. В данной статье представлен валидированный протокол dd_PCR для количественной оценки геномов векторов AAV в очищенных образцах векторов (рис. 2).

Пристальное внимание к работе с образцами имеет решающее значение при выполнении этого протокола. Перекрестное загрязнение может представлять значительную проблему для точной оценки титров vg; поэтому образцы лучше всего обрабатывать под рабочей станцией ПЦР, чтобы избежать загрязнения чужеродной ДНК. Кроме того, правильное проведение инкубации ДНКазы имеет решающее значение для уничтожения неупакованной загрязняющей ДНК без нарушения капсида и потенциального переваривания упакованного векторного генома. Многие протоколы включают тепловую инактивацию и лечение протеиназой К 16,17,18. Тем не менее, в ходе разработки собственного метода было обнаружено, что чрезмерный нагрев вреден для титрования vg, а лечение протеиназой К не является необходимым (данные не показаны).

Поскольку dd_PCR становится все более популярным для количественного определения вирусных геномов, производители опубликовали подробные руководства по применению с рекомендациями по разработке и оптимизации анализов dd_PCR¹⁹. Также доступна информация об устранении неполадок. На практике, когда анализ правильно составлен, наиболее частыми проблемами являются дождь из капель и низкое количество капель. Дождь из капель часто вызван плохим доступом праймера/зондов к ампликону, но несколько стратегий могут решить эту проблему. Например, эксперимент с температурным градиентом может помочь установить оптимальную температуру отжига. Кроме того, разбавление образцов для снижения количества ДНК (рекомендуется менее 66 нг) или выполнение рестрикционного расщепления с определенными ферментами, которые выходят за пределы ампликонной области, может улучшить доступность шаблонов. Рекомендуемая концентрация фермента рестрикции в 10 ЕД на мкг ДНК обычно эффективна. Проблема низкого количества капель (менее 10 000) часто связана с плохим пипетированием образца и маслом в картриджах. Рекомендуется медленное пипетирование с соответствующими наконечниками, чтобы избежать сдвига капель. Несмотря на то, что dd_PCR анализ надежен, одним из ограничений является увеличенное время получения результата. Процесс от обработки образца до считывания капель занимает несколько часов, что может быть недостатком, когда результаты нужны быстро.

Точное количественное определение копий генома AAV в векторных препаратах необходимо на всех этапах жизненного цикла генной терапии AAV. В частности, это важно для оптимизации процессов производства и очистки, проведения доклинических исследований и определения клинических дозировок для продуктов генной терапии на основе AAV. Представленный здесь протокол dd_PCR широко применим и может быть использован на очищенных продуктах AAV с различными серотипами и трансгенами.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-channel pipette 10 µL	Eppendorf	3,12,50,00,010
8-channel pipette 200 µL	Eppendorf	3,12,50,00,036
8-channel pipette 300 µL	Eppendorf	3,12,50,00,052
8-well PCR strip	Sarstedt	72.991.002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
ddPCR Buffer Control for Probes 9 mL (2 x 4.5 mL)	Bio-Rad	1863052
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (2 x 1 mL)	Bio-Rad	1863023
ddPCR 96-Well Plates (pkg of 25)	Bio-Rad	12001925
ddPCR Droplet Reader Oil (2 x 1L)	Bio-Rad	1863004
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad	1863051
DG8 Cartridges for QX200/QX100 (pkg of 24)	Bio-Rad	1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 (pkg of 24)	Bio-Rad	1863009
DNase I (10U/µL) + buffer	Roche	4716728001
Droplet Generation Oil for Probes (10 x 7 mL)	Bio-Rad	1863005
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 0.1-10 μL, 34 mm, Rack, PCR Clean, STERILE	Eppendorf	30078500
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 20-300 μL, 55 mm, Rack, PCR Clean, STERILE	Eppendorf	30078560
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 2-100 μL, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERILE	Eppendorf	30078543
Forward lyophilized primers and respective master stocks at 100 mM	IDT		GFP as target sequence. Forward primer: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'
Lyopohilized probe and master stock at 100 µM	IDT		GFP as target sequence. PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/
Magnesium Chloride (MgCl2)	Chemlab Analytical	CL00.1381
Nuclease free water	IDT	11-04-02-01
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable (pkg of 100)	Bio-Rad	1814040
Pluronic F-68 non-ionic surfactant (100x)	Thermo Fisher Scientific	24040032
Potassium Chloride (KCl)	Honeywell research chemicals	31248
QX manager software	Bio-Rad		Software to analyse ddPCR data
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Reagent reservoir	VWR	613-1181
Reverse lyophilized primers and respective master stocks at 100 mM	IDT		GFP as target sequence. Reverse primer: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL	Sarstedt	72.706.200
Salmon Sperm DNA, sheared (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM9680
TE buffer	IDT		Accompanied by primers when ordering
Tris hydrochloride (Tris-HCl)	Roche	10812846001