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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

University of Alabama Huntsville

TnaC &#x65B0;&#x751F;&#x80BD;&#x7684;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x6291;&#x5236;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x6D3B;&#x52A8;&#x5B58;&#x5728;&#x8BF1;&#x5BFC; tnaCAB &#x57FA;&#x56E0;&#x5728;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684; l-&#x8272;&#x6C28;&#x9178;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x4F7F;&#x7528;&#x5316;&#x5B66;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#xFF0C;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86; TnaC &#x4E0E;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x5982;&#x4F55;&#x53D7;&#x5230;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x5206;&#x5B50;&#x4E2D;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;TnaC-tRNA(Pro) &#x9170;-tRNA &#x5185;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x5B58;&#x5728;&#x4FDD;&#x62A4; 23 &#x578B;&#x98DE;&#x673A; rRNA &#x6838;&#x82F7;&#x9178; U2609 &#x5BF9;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x3002;&#x5305;&#x542B; 23 &#x578B;&#x98DE;&#x673A; rRNA &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684; A748 A752 &#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x4E0D;&#x8BF4;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x4FDD;&#x62A4;&#x3002;&#x6838;&#x82F7;&#x9178; A752 &#x548C; U2609 &#x5EFA;&#x7ACB;&#x4E00;&#x4E2A;&#x78B1;&#x57FA;&#x5BF9;&#x4E92;&#x52A8;&#x3002;A752 &#x6216; U2609 &#x7684;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x66F4;&#x6362;&#x53D7;&#x5F71;&#x54CD;&#x8DE8;&#x56FD;&#x6FC0;&#x8FDB;&#x515A;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x7684; TnaC &#x8C03;&#x8282; LacZ &#x8BB0;&#x8005;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x66F4;&#x6539; A752G &#x6216;&#x53CC;&#x66FF;&#x6362; A752G &#x548C; U2609C&#xFF0C;&#x7EF4;&#x6301;&#x8DE8;&#x56FD;&#x6FC0;&#x8FDB;&#x515A;&#x611F;&#x5E94;&#x3002;&#x66F4;&#x6362;&#x5B88;&#x6052;&#x7684; W12 &#x548C; D16 TnaC &#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x4E5F;&#x5E9F;&#x9664;&#x7531; TnaC-tRNA(Pro) U2609 &#x9632;&#x62A4;&#x5316;&#x5B66;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x9000;&#x51FA;&#x96A7;&#x9053;&#x7684;&#x65B0;&#x751F;&#x80BD; TnaC &#x4E0E; U2609 &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x4EA4;&#x4E92;&#x65F6;&#xFF0C;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x662F;&#x8DE8;&#x56FD;&#x6FC0;&#x8FDB;&#x515A;&#x4F5C;&#x51FA;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x88AB;&#x53D7;&#x7A81;&#x53D8;&#x5728;&#x9000;&#x51FA;&#x96A7;&#x9053;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684; rRNA 23 &#x578B;&#x98DE;&#x673A;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5728;&#x5B88;&#x6052; TnaC &#x6B8B;&#x7559;&#xFF0C;&#x6697;&#x793A;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5F71;&#x54CD;&#x9000;&#x51FA;&#x96A7;&#x9053;&#x548C; &#xFF08;&#x6216;&#xFF09;&#xFF0C;&#x96A7;&#x9053;&#x5185;&#x7684;&#x65B0;&#x751F;&#x80BD;&#x914D;&#x7F6E;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;

&#x4FDD;&#x6301;&#x76D1;&#x7BA1; TnaC &#x80BD;&#x4E0E;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x9000;&#x51FA;&#x96A7;&#x9053;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x8D1F;&#x8D23;&#x8DE8;&#x56FD;&#x6FC0;&#x8FDB;&#x515A;&#x7684;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x56E0;&#x7D20;&#x3002;

Translation of the TnaC nascent peptide inhibits ribosomal activity in the presence of l-tryptophan, inducing expression of the tnaCAB operon in Escherichia coli. Using chemical methylation, this work reveals how interactions between TnaC and the ribosome are affected by mutations in both molecules. The presence of the TnaC-tRNA(Pro) peptidyl-tRNA within the ribosome protects the 23S rRNA nucleotide U2609 against chemical methylation. Such protection was not observed in mutant ribosomes containing changes in 23S rRNA nucleotides of the A748-A752 region. Nucleotides A752 and U2609 establish a base-pair interaction. Most replacements of either A752 or U2609 affected Trp induction of a TnaC-regulated LacZ reporter. However, the single change A752G, or the dual replacements A752G and U2609C, maintained Trp induction. Replacements at the conserved TnaC residues W12 and D16 also abolished the protection of U2609 by TnaC-tRNA(Pro) against chemical methylation. These data indicate that the TnaC nascent peptide in the ribosome exit tunnel interacts with the U2609 nucleotide when the ribosome is Trp responsive. This interaction is affected by mutational changes in exit tunnel nucleotides of 23S rRNA, as well as in conserved TnaC residues, suggesting that they affect the structure of the exit tunnel and/or the nascent peptide configuration in the tunnel.

Crucial elements that maintain the interactions between the regulatory TnaC peptide and the ribosome exit tunnel responsible for Trp inhibition of ribosome function.

Traduction du peptide TNAC naissante inhibe l&#x26;#39;activit&#xE9; ribosomique en pr&#xE9;sence de L-tryptophane, induire l&#x26;#39;expression de l&#x26;#39;op&#xE9;ron tnaCAB dans Escherichia coli. Utilisation de m&#xE9;thylation chimique, ce travail r&#xE9;v&#xE8;le comment les interactions entre CCNT et le ribosome sont affect&#xE9;s par des mutations dans les deux mol&#xE9;cules. La pr&#xE9;sence de la CCNT-ARNt (Pro) peptidyl-ARNt dans le ribosome prot&#xE8;ge les U2609 ARNr 23S nucl&#xE9;otidiques contre m&#xE9;thylation chimique. Cette protection n&#x26;#39;a pas &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9; dans les ribosomes mutants contenant des changements dans nucl&#xE9;otides ARNr 23S de la r&#xE9;gion A748-A752. Nucl&#xE9;otides A752 et U2609 &#xE0; &#xE9;tablir une interaction de paires de bases. La plupart des remplacements de deux A752 ou U2609 affect&#xE9;s &#xE0; induction Trp d&#x26;#39;un journaliste du CCNT-r&#xE9;glement&#xE9; LacZ. Toutefois, l&#x26;#39;A752G seul changement, ou la double remplacements A752G et U2609C, maintenu par induction Trp. Remplacements &#xE0; des r&#xE9;sidus conserv&#xE9;s CCNT W12 et D16 a &#xE9;galement aboli la protection des U2609 par CCNT-ARNt (Pro) contre la m&#xE9;thylation chimique. Ces donn&#xE9;es indiquent que le peptide CCNT naissante dans le tunnel de sortie du ribosome interagit avec le nucl&#xE9;otide U2609 lorsque le ribosome est Trp sensibles. Cette interaction est affect&#xE9;e par les changements mutationnels dans nucl&#xE9;otides tunnel de sortie de l&#x26;#39;ARNr 23S, ainsi que dans les r&#xE9;sidus CCNT conserv&#xE9;es, ce qui sugg&#xE8;re que leur incidence sur la structure du tunnel de sortie et / ou la configuration peptide naissant dans le tunnel.

&#xC9;l&#xE9;ments cruciaux qui maintiennent les interactions entre le peptide CCNT de la r&#xE9;glementation et le tunnel de sortie du ribosome responsable de l&#x26;#39;inhibition de la fonction des ribosomes Trp

&Uuml;bersetzung des entstehenden Peptids TnaC hemmt ribosomal Aktivit&auml;t in Anwesenheit von l-Tryptophan, induzierende Ausdruck der TnaCAB-Operon in Escherichia coli. Verwenden chemische Methylierung, zeigt diese Arbeit wie die Wechselwirkungen zwischen TnaC und dem Ribosom durch Mutationen in beiden Molek&uuml;le betroffen sind. Das Vorhandensein von TnaC-tRNA(Pro) konvertierende-tRNA innerhalb der Ribosom sch&uuml;tzt die 23S rRNA Nukleotid U2609 gegen chemische Methylierung. Dieser Schutz wurde nicht in mutant Ribosomen mit &Auml;nderungen in 23S rRNA Nukleotide der Region A748-A752 beobachtet. Nukleotide A752 und U2609 Gr&uuml;nden eine Basenpaar Interaktion. Die meisten Ersetzungen A752 oder U2609 betroffen Trp Induktion von TnaC regulierte LacZ Reporter. Jedoch beibehalten, die einzelne &Auml;nderung A752G oder die dualen Ersetzungen, A752G und U2609C, Trp-Induktion. Ersatz bei konservierten TnaC R&uuml;ckst&auml;nde W12 und D16 abgeschafft auch den Schutz der U2609 von TnaC-tRNA(Pro) gegen chemische Methylierung. Diese Daten zeigen, dass die U2609 Nukleotid TnaC entstehenden Peptids im Tunnel Ausfahrt Ribosom interagiert, wenn das Ribosom Trp reaktionsf&auml;hig ist. Diese Interaktion wird durch teilhabende &Auml;nderungen in Ausfahrt Tunnel Nukleotide der 23S rRNA sowie in konservierten TnaC R&uuml;ckst&auml;nde, was darauf hindeutet, dass sie die Struktur der Ausfahrt Tunnel bzw. die entstehenden Peptid-Konfiguration im Tunnel beeinflussen beeinflusst.

Wesentliche Elemente, die die Interaktionen zwischen den regulatorischen TnaC-Peptid und das Ribosom Ausfahrt Tunnel verantwortlich f&uuml;r Trp Hemmung der Ribosom Funktion beibehalten.

Traduzione del peptide nascente TnaC inibisce l&#39;attivit&agrave; ribosomiale in presenza di l-triptofano, inducendo l&#39;espressione dell&#39;operone tnaCAB in Escherichia coli. Mediante la metilazione chimica, questo lavoro rivela come le interazioni tra TnaC e il ribosoma sono colpite da mutazioni in due molecole. La presenza degli TnaC-tRNA(Pro) peptidilica-tRNA all&#39;interno del ribosoma protegge il nucleotide di rRNA 23S U2609 contro la metilazione in chimica. Tale protezione non &egrave; stata osservata nel mutanti ribosomi contenenti modifiche in nucleotidi rRNA 23S della regione A748-A752. A752 nucleotidi e U2609 stabilire un&#39;interazione di coppia di basi. La maggior parte delle sostituzioni di A752 o U2609 colpito Trp induzione di un reporter LacZ TnaC-regolato. Tuttavia, l&#39;unico cambiamento A752G, o le sostituzioni duale A752G e U2609C, mantenuta ad induzione Trp. Sostituzioni presso i residui conservati TnaC W12 e D16 abol&igrave; anche la protezione di U2609 di TnaC-tRNA(Pro) contro la metilazione in chimica. Questi dati indicano che il peptide nascente TnaC nel tunnel di uscita del ribosoma interagisce con il nucleotide U2609 quando il ribosoma &egrave; Trp reattivo. Questa interazione &egrave; interessata dalle modifiche mutazionale in nucleotidi tunnel uscita di 23S rRNA, cos&igrave; come in residui conservati TnaC, suggerendo che influenzano la struttura del tunnel di uscita e/o la configurazione del peptide nascente nel tunnel.

Elementi cruciali che mantengono le interazioni tra il peptide TnaC normativo e il tunnel di uscita ribosoma responsabile Trp inibizione della funzione del ribosoma.

TnaC&#x65B0;&#x751F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x7FFB;&#x8A33;&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;tnaCAB&#x30AA;&#x30DA;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3059;&#x308B;&#x3001;L-&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30F3;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x5316;&#x5B66;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x54C1;&#x306F;TnaC&#x3068;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x308B;&#x304B;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x5185;TnaC-tRNA&#x306E;&#xFF08;&#x30D7;&#x30ED;&#xFF09;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;-tRNA&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x306F;&#x3001;&#x5316;&#x5B66;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;23S rRNA&#x306E;&#x5869;&#x57FA;U2609&#x3092;&#x4FDD;&#x8B77;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x4FDD;&#x8B77;&#x306F;&#x3001;A748-A752&#x306E;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;23S rRNA&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3067;&#x306F;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x5869;&#x57FA;&#x5BFE;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;A752&#x3068;U2609&#x3002; A752&#x307E;&#x305F;&#x306F;U2609&#x306E;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306E;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x4EA4;&#x63DB;&#x306F;&#x3001;TnaC&#x8ABF;&#x7BC0;LacZ&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;Trp&#x306E;&#x8A98;&#x5C0E;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;A752G&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x4EE3;&#x66FF;A752G&#x3068;U2609C&#x306F;&#x3001;Trp&#x306E;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;TnaC&#x6B8B;&#x57FA;W12&#x304A;&#x3088;&#x3073;D16&#x3067;&#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x5316;&#x5B66;&#x306E;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;TnaC-tRNA&#x306E;&#xFF08;&#x30D7;&#x30ED;&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x308B;U2609&#x306E;&#x4FDD;&#x8B77;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C;Trp&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x6642;&#x306B;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x51FA;&#x53E3;&#x30C8;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x5185;TnaC&#x65B0;&#x751F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;U2609&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x51FA;&#x53E3;&#x306E;&#x30C8;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3001;&#x305D;&#x3057;&#x3066;/&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x5185;&#x306E;&#x65B0;&#x751F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A3;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;23S rRNA&#x306E;&#x51FA;&#x53E3;&#x30C8;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x3001;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;TnaC&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x898F;&#x5236;TnaC&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3068;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;Trp&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x51FA;&#x53E3;&#x30C8;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x8981;&#x7D20;

TnaC &#xCD08;&#xAE30; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xBC88;&#xC5ED; l-&#xD2B8;&#xB9BD;&#xD1A0;&#xD310;, &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC5D0;&#xC11C; tnaCAB &#xC624; &#xD398;&#xB860; &#xC2DD; &#xC720;&#xB3C4; &#xC874;&#xC7AC; ribosomal &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC5B5;&#xC81C; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xD654;&#xD559; &#xBA54; &#xD2F8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xC774; &#xC791;&#xD488; &#xB450; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xBCC0;&#xC774; &#xC758;&#xD574; Tnac&#xC640;&#xB294; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;. TnaC-tRNA(Pro) peptidyl-Trna&#xB294; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xB0B4; &#xC874;&#xC7AC; 23S rRNA &#xC5FC;&#xAE30; U2609 &#xD654;&#xD559; &#xBA54; &#xD2F8; &#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xD638;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBCF4;&#xD638; &#xD558;&#xC9C0; A748 A752 &#xC601;&#xC5ED;&#xC758; 23S rRNA &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC5D0; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; A752 &#xBC0F; U2609 &#xAE30;&#xBCF8; &#xD398;&#xC5B4; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC124;&#xC815;&#xD560;. A752 &#xB610;&#xB294; u2609&#xC758; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xAD50;&#xCCB4; TnaC &#xADDC;&#xC81C; LacZ &#xAE30;&#xC790;&#xC758; Trp &#xC720;&#xB3C4;&#xB97C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xB2E8;&#xC77C; &#xBCC0;&#xACBD; A752G, &#xB610;&#xB294; A752G &#xBC0F; U2609C, &#xB4C0;&#xC5BC; &#xAD50;&#xCCB4; Trp &#xC720;&#xB3C4; &#xC720;&#xC9C0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; TnaC &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; W12 &#xBC0F; d16&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD50;&#xCCB4;&#xC5D0;&#xB294; &#xD654;&#xD559; &#xBA54; &#xD2F8; &#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; U2609 Tnac-trna(pro)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBCF4;&#xD638;&#xB97C; &#xC5C6; &#xC574; &#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; Trp &#xBC18;&#xC751; &#xB54C; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xCD9C;&#xAD6C; &#xD130;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; TnaC &#xCD08;&#xAE30; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; U2609 &#xC5FC;&#xAE30;&#xC640; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; 23S Rrna&#xC758; &#xCD9C;&#xAD6C; &#xD130;&#xB110; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xCD9C;&#xAD6C; &#xD130;&#xB110; &#xD130;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD08;&#xAE30; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAD6C;&#xC131;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; TnaC &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; mutational &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Trp &#xC5B5;&#xC81C;&#xC758; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784; &#xADDC;&#xC815; TnaC &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC640; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xCD9C;&#xAD6C; &#xD130;&#xB110; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC694;&#xC18C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Traducci&#xF3;n del p&#xE9;ptido naciente TnaC inhibe la actividad ribos&#xF3;mica en presencia de L-tript&#xF3;fano, inducir la expresi&#xF3;n del oper&#xF3;n tnaCAB en Escherichia coli. Uso de la metilaci&#xF3;n del producto qu&#xED;mico, este trabajo pone de manifiesto c&#xF3;mo las interacciones entre TnaC y el ribosoma se ven afectados por las mutaciones en ambas mol&#xE9;culas. La presencia de la TnaC-ARNt (Pro) peptidil-ARNt en el ribosoma protege los 23S U2609 rRNA nucle&#xF3;tidos contra metilaci&#xF3;n qu&#xED;mica. Dicha protecci&#xF3;n no se observ&#xF3; en los ribosomas mutantes que contienen cambios en 23S rRNA nucle&#xF3;tidos de la regi&#xF3;n A748-A752. Los nucle&#xF3;tidos A752 y U2609 a establecer una interacci&#xF3;n de pares de bases. La mayor&#xED;a de los reemplazos de cualquiera de A752 o U2609 afectados por inducci&#xF3;n de un reportero Trp TnaC regulado LacZ. Sin embargo, la A752G solo cambio, o el doble A752G reemplazos y U2609C, mantiene la inducci&#xF3;n de Trp. Sustituciones en los residuos conservados TnaC G12 y D16 tambi&#xE9;n aboli&#xF3; la protecci&#xF3;n de los U2609 por TnaC-tRNA (Pro) en contra de la metilaci&#xF3;n qu&#xED;mica. Estos datos indican que el p&#xE9;ptido TnaC naciente en el t&#xFA;nel de salida ribosoma interact&#xFA;a con el nucle&#xF3;tido U2609 cuando el ribosoma es Trp sensible. Esta interacci&#xF3;n se ve afectado por los cambios mutacionales en nucle&#xF3;tidos salida del t&#xFA;nel de 23S ARNr, as&#xED; como en los residuos TnaC conservadas, lo que sugiere que afectan a la estructura del t&#xFA;nel de salida y / o la configuraci&#xF3;n p&#xE9;ptido naciente en el t&#xFA;nel.

Elementos esenciales que mantienen las interacciones entre el p&#xE9;ptido TnaC Regulador y el t&#xFA;nel de salida responsable ribosoma para la inhibici&#xF3;n de la funci&#xF3;n del ribosoma Trp

Nitin Shirole

Department of Biological Sciences

University of Alabama Huntsville

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Nitin Shirole

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University of Alabama Huntsville

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Department of Biological Sciences