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Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Arnold School of Public Health, University of South Carolina

&#x7531;&#x4E8E;&#x80DE;&#x5916;&#x805A;&#x5408;&#x7269; &#xFF08;&#x4EE5;&#x4FBF;&#x5728;&#x5E7C;&#x5E74;&#xFF09; &#x548C;&#x76D0;&#x7B49;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#xFF0C;&#x6700;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x7814;&#x7A76;&#x4F9D;&#x9760;&#x4E25;&#x9177;&#x76F4;&#x63A5; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4EA7;&#x751F;&#x51FA;&#x7684;&#x592A;&#x5C0F;&#xFF0C;&#x5927;&#x63D2;&#x5165;&#x8F7D;&#x4F53;&#x514B;&#x9686;&#x7684; DNA &#x7247;&#x6BB5;&#x3002;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; &#xFF08;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF;&#xFF09; DNA &#x529F;&#x80FD;&#x5B8F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5927;&#x7684;&#x788E;&#x7247;&#x76EE;&#x524D;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x66F4;&#x591A;&#x5730;&#x83B7;&#x5F97;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; DNA &#x63D0;&#x53D6; EPS &#x5BCC;&#x542B;&#x76D0;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5F97;&#x5230;&#x6539;&#x8FDB;&#x3002;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B; &#x4E3A; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x805A;&#x4E59;&#x4E8C;&#x9187; (PEG) &#x964D;&#x6C34;&#x8DDF;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x79BB;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E0E;&#x673A;&#x68B0;&#x548C;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B; &#x6536;&#x76CA;&#x7387; &gt; 2 &#x5FAE;&#x514B;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; DNA (&gt; 48 kb) &#x6BCF;&#x514B;&#x57AB;&#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x4E0E; A260:280 &#x6BD4;&#x7387; &gt; 1.7&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x53D8;&#x6027;&#x68AF;&#x5EA6;&#x51DD;&#x80F6;&#x7535;&#x6CF3;&#x548C;&#x7126;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x6280;&#x672F;&#x7684; 16S rRNA &#x57FA;&#x56E0;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x672C;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66;&#x4EE3;&#x8868; DNA&#x3001; &#x63D0;&#x53D6;&#x7269;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x793E;&#x533A;&#x4E2D;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7684;&#x6574;&#x4F53;&#x8BA1;&#x7B97;&#x7684;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x6307;&#x6570;&#xFF0C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x5176;&#x4ED6;&#x4E09;&#x4E2A;&#x6807;&#x51C6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x5B8F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5B66;&#x7528;&#x4E8E;&#x786E;&#x4FDD;&#x6700;&#x4F73;&#x6062;&#x590D;&#x7684;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3002;

&#x4ECE;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x7684;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; DNA &#x7684;&#x63D0;&#x53D6;&#x3002;

Due to the presence of inhibitors such as extracellular polymeric substances (EPSs) and salts, most microbial mat studies have relied on harsh methods of direct DNA extraction that result in DNA fragments too small for large-insert vector cloning. High molecular weight (HMW) DNA is crucial in functional metagenomic studies, because large fragments present greater access to genes of interest. Here we report improved methodologies for extracting HMW DNA from EPS-rich hypersaline microbial mats. The protocol uses a combination of microbial cell separation with mechanical and chemical methods for DNA extraction and purification followed by precipitation with polyethylene glycol (PEG). The protocol yields >2 Âµg HMW DNA (>48 kb) per gram of mat sample, with A260:280 ratios >1.7. In addition, 16S rRNA gene analysis using denaturing gradient gel electrophoresis and pyrosequencing showed that this protocol extracts representative DNA from microbial mat communities and results in higher overall calculated diversity indices compared with three other standard methods of DNA extraction. Our results show the importance of validating the DNA extraction methods used in metagenomic studies to ensure optimal recovery of microbial richness.

Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.

En raison de la pr&#xE9;sence d&#x26;#39;inhibiteurs tels que les substances polym&#xE9;riques extracellulaires (EPS) et les sels, les &#xE9;tudes les plus mat microbiennes se sont appuy&#xE9;s sur des m&#xE9;thodes dures d&#x26;#39;extraction directe de l&#x26;#39;ADN qui se traduisent par des fragments d&#x26;#39;ADN trop petit pour le vecteur de clonage &#xE0; grande insert. De haut poids mol&#xE9;culaire (HMW) de l&#x26;#39;ADN est cruciale dans les &#xE9;tudes m&#xE9;tag&#xE9;nomiques fonctionnelles, parce que de gros fragments de pr&#xE9;senter un plus grand acc&#xE8;s &#xE0; des g&#xE8;nes d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t. Nous rapportons ici des m&#xE9;thodologies am&#xE9;lior&#xE9;es pour l&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN &#xE0; partir de HMW-EPS riches tapis microbiens hypersalins. Le protocole utilise une combinaison de la s&#xE9;paration des cellules microbiennes avec des m&#xE9;thodes m&#xE9;caniques et chimiques pour l&#x26;#39;extraction et la purification d&#x26;#39;ADN suivie d&#x26;#39;une pr&#xE9;cipitation avec le poly&#xE9;thyl&#xE8;neglycol (PEG). Les rendements du protocole&#x26;gt; 2 ug d&#x26;#39;ADN HMW (&#x26;gt; 48 kb) par gramme d&#x26;#39;&#xE9;chantillon mat, avec A260: 280 rapports&#x26;gt; 1,7. En outre, l&#x26;#39;analyse du g&#xE8;ne 16S ARNr utilisant &#xE9;lectrophor&#xE8;se sur gel d&#xE9;naturant gradient et pyros&#xE9;quen&#xE7;age a montr&#xE9; que ce protocole extrait l&#x26;#39;ADN repr&#xE9;sentant de communaut&#xE9;s microbiennes tapis et des r&#xE9;sultats globaux plus &#xE9;lev&#xE9;s dans les indices de diversit&#xE9; calcul&#xE9;s par rapport &#xE0; trois autres m&#xE9;thodes standard d&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN. Nos r&#xE9;sultats montrent l&#x26;#39;importance de la validation des m&#xE9;thodes d&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN utilis&#xE9;s dans les &#xE9;tudes m&#xE9;tag&#xE9;nomiques pour assurer une r&#xE9;cup&#xE9;ration optimale de la richesse microbienne.

Extraction d&#x26;#39;ADN haut poids mol&#xE9;culaire de tapis microbiens

Durch die Anwesenheit von Inhibitoren wie extrazellul&auml;rer polymerer Substanzen (EPSs) und Salze haben die meisten mikrobielle Matte Studien auf rauen Methoden der direkten DNA-Extraktion verlassen, die DNA-Fragmente zu klein f&uuml;r gro&szlig;e-Insert Vektor Klonen f&uuml;hren. Hochmolekulare (HMW) DNA ist entscheidend in funktionale durchgef&uuml;hrte metagenomische Studien, weil gro&szlig;e Fragmente besseren Zugang zu den Genen des Interesses zu pr&auml;sentieren. Hier berichten wir &uuml;ber verbesserte Methoden zur Extraktion von HMW-DNA aus EPS-reiche hypersaliner mikrobielle Matten. Das Protokoll verwendet eine Kombination von mikrobiellen Zellseparation mit mechanischen und chemischen Methoden zur DNA-Extraktion und Reinigung mit anschlie&szlig;ender Ausf&auml;llung mit Polyethylenglykol (PEG). Das Protokoll ergibt &gt; 2 &micro;g DNA HMW (&gt; 48KB) pro Gramm Mat Probe mit A260:280-Verh&auml;ltnissen &gt; 1.7. 16S rRNA-gen-Analyse mit Denaturierung Gradienten Gelelektrophorese und Pyrosequencing zeigte au&szlig;erdem, dass dieses Protokoll von Mat Mikrobengemeinschaften und f&uuml;hrt zu h&ouml;heren insgesamt berechneten Vielfalt Indizes verglichen mit drei anderen standard-Methoden der DNA-Extraktion Vertreter DNA extrahiert. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Validierung der DNA-Extraktion-Methods in durchgef&uuml;hrte metagenomische Studien zur optimalen Regeneration der mikrobiellen Reichtum zu gew&auml;hrleisten.

Extraktion von hochmolekulare DNA von mikrobiellen Matten.

A causa della presenza di inibitori quali sostanze polimeriche extracellulari (EPSs) e sali, studi mat microbici pi&ugrave; hanno contato su duri metodi di estrazione diretta di DNA che si traducono in frammenti di DNA troppo piccoli per grande inserto vettore di clonazione. DNA ad elevato peso molecolare (HMW) &egrave; cruciale negli studi funzionali metagenomica, perch&eacute; grossi frammenti presentano maggiore accesso ai geni di interesse. Qui riportiamo migliorate metodologie per l&#39;estrazione del DNA HMW da tappeti microbici EPS-rich ipersaline. Il protocollo utilizza una combinazione di separazione delle cellule microbiche con metodi meccanici e chimici per l&#39;estrazione del DNA e purificazione seguita da precipitazione con polietilenglicole (PEG). Il protocollo di rendimenti &amp;gt; 2 &micro; g di DNA HMW (&amp;gt; 48 kb) per grammo di campione opaco, con rapporti A260:280 &amp;gt; 1.7. Inoltre, analisi del gene 16S rRNA mediante denaturazione pyrosequencing ed elettroforesi del gel di pendenza ha mostrato che questo protocollo estratti DNA rappresentante dalla comunit&agrave; microbiche mat e risultati pi&ugrave; elevati indici di diversit&agrave; complessiva calcolata confrontato con tre altri metodi standard di estrazione del DNA. I nostri risultati dimostrano l&#39;importanza della convalida i metodi di estrazione del DNA utilizzati negli studi di metagenomica per garantire un recupero ottimale di ricchezza microbica.

Estrazione di alto peso molecolare del DNA da tappeti microbici.

&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x7269;&#x8CEA;&#xFF08;EPS&#x306B;&#xFF09;&#x3084;&#x5869;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;DNA&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x306F;&#x5C0F;&#x3055;&#x3059;&#x304E;&#x308B;&#x65AD;&#x7247;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x306E;&#x904E;&#x9177;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x983C;&#x3063;&#x3066;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x5927;&#x65AD;&#x7247;&#x306F;&#x3001;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3078;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF;&#xFF08;HMW&#xFF09;&#x306E;DNA&#x306F;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x30E1;&#x30BF;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;EPS-&#x8C4A;&#x5BCC;&#x306A;&#x821F;&#x306E;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;HMW DNA&#x3092;&#x62BD;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6539;&#x5584;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30A8;&#x30C1;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30FC;&#x30EB;&#xFF08;PEG&#xFF09;&#x6C88;&#x6BBF;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x3068;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6A5F;&#x68B0;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x624B;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5206;&#x96E2;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306E;&#x5229;&#x56DE;&#x308A;&#x26;gt;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;1g&#x5F53;&#x305F;&#x308A;2&#x3BC;g&#x306E;HMW DNA&#xFF08;&#x26;gt; 48&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#xFF09;&#x3001;A260&#x3068;280&#x306E;&#x6BD4;&#x26;gt; 1.7&#x3002;&#x5909;&#x6027;&#x52FE;&#x914D;&#x30B2;&#x30EB;&#x96FB;&#x6C17;&#x6CF3;&#x52D5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3001;&#x30D1;&#x30A4;&#x30ED;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x3001;16S rRNA&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;3&#x3064;&#x306E;&#x6A19;&#x6E96;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3068;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x8A08;&#x7B97;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x6307;&#x6A19;&#x306E;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30B3;&#x30DF;&#x30E5;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x3068;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x304B;&#x3089;&#x4EE3;&#x8868;&#x7684;&#x306A;DNA&#x3092;&#x62BD;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x8C4A;&#x304B;&#x3055;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3092;&#x78BA;&#x5B9F;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30BF;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x7528;&#x3044;&#x305F;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x6CD5;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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&#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790; &#xBB3C;&#xC9C8; (Eps)&#xACFC; &#xC18C;&#xAE08; &#xAC19;&#xC740; &#xC874;&#xC7AC;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xB108;&#xBB34; &#xD070; &#xC0BD;&#xC785; &#xBCA1;&#xD130; &#xD074;&#xB85C;&#xB2DD;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC791;&#xC740; DNA &#xC870;&#xAC01; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418;&#xB294; &#xAC00;&#xD639;&#xD55C; &#xC9C1;&#xC811; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD070; &#xC870;&#xAC01; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xB354; &#xC911;&#xB300; &#xD55C; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC81C;&#xC2DC; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xACE0; &#xBD84;&#xC790;&#xB7C9; (HMW) DNA &#xAE30;&#xB2A5; metagenomic &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815;&#xC801; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; EPS &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; hypersaline &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; HMW DNA&#xB97C; &#xCD94;&#xCD9C; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xBC0F; &#xC815;&#xC218; &#xB4A4;&#xC5D0; &#xD3F4; &#xB9AC; &#xC5D0;&#xD2F8;&#xB80C; &#xAE00;&#xB9AC;&#xCF5C; (&#xD398;&#xADF8;)&#xC640; &#xAC15; &#xC218;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xACC4;&#xC801;, &#xD654;&#xD559;&#xC801; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xB9AC;&#xC758; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xC218;&#xC775;&#xB960; &amp;gt; 2 &micro; g HMW DNA (&amp;gt; 48 kb) A260:280 &#xBE44;&#xC728; &#xB9E4;&#xD2B8; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC758; &#xADF8;&#xB7A8; &#xB2F9; &amp;gt; 1.7. &#xB610;&#xD55C; 16S rRNA &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D; &#xBCC0;&#xC131; &#xADF8;&#xB77C;&#xB370;&#xC774;&#xC158; &#xC824; &#xC804;&#xAE30; &#xC774;&#xB3D9; &#xBC95; &#xBC0F; pyrosequencing&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xC774; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8; &#xC0AC;&#xD68C;&#xC640; DNA &#xCD94;&#xCD9C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD45C;&#xC900; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xACC4;&#xC0B0;&#xB41C; &#xB2E4;&#xC591;&#xC131; &#xC9C0;&#xD45C; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xD45C; DNA&#xB97C; &#xCD94;&#xCD9C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xBC29;&#xBC95; metagenomic &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xD48D;&#xC694;&#xB85C; &#xC6C0;&#xC758; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC7A5; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131; &#xAC80;&#xC0AC;&#xC758; &#xC911;&#xC694;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB192;&#xC740; &#xBD84;&#xC790;&#xB7C9; DNA &#xCD94;&#xCD9C;.

Debido a la presencia de inhibidores, tales como sustancias polim&#xE9;ricas extracelulares (EPS) y las sales, los estudios m&#xE1;s estera microbianas se han basado en m&#xE9;todos &#xE1;speros de extracci&#xF3;n directa de ADN que dan lugar a fragmentos de ADN demasiado peque&#xF1;o para vector de clonaci&#xF3;n a gran inserci&#xF3;n. De alto peso molecular (HMW) de ADN es crucial en estudios metagenomic funcionales, porque los fragmentos grandes presentan mayor acceso a los genes de inter&#xE9;s. Aqu&#xED; mostramos metodolog&#xED;as mejoradas para la extracci&#xF3;n de ADN de alto peso molecular de la EPS-ricos tapetes microbianos hipersalinos. El protocolo utiliza una combinaci&#xF3;n de separaci&#xF3;n de c&#xE9;lulas microbianas con m&#xE9;todos mec&#xE1;nicos y qu&#xED;micos para la extracci&#xF3;n y purificaci&#xF3;n del ADN, seguido de precipitaci&#xF3;n con polietilenglicol (PEG). Los rendimientos de protocolo&#x26;gt; 2 g de ADN HMW (&#x26;gt; 48 kb) por gramo de muestra estera, con A260: 280 coeficientes&#x26;gt; 1,7. Adem&#xE1;s, el an&#xE1;lisis del gen 16S ARNr mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y pirosecuenciaci&#xF3;n puso de manifiesto que este protocolo extrae ADN representante de las comunidades de esteras microbianas y los resultados m&#xE1;s altos en los &#xED;ndices globales de diversidad calculados en comparaci&#xF3;n con los otros tres m&#xE9;todos est&#xE1;ndar de extracci&#xF3;n de ADN. Nuestros resultados muestran la importancia de validar los m&#xE9;todos de extracci&#xF3;n de ADN utilizados en estudios de metagen&#xF3;mica para asegurar una recuperaci&#xF3;n &#xF3;ptima de la riqueza microbiana.

Benjamin S. Bey

Department of Environmental Health Sciences

Arnold School of Public Health, University of South Carolina

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats