expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

University of Manchester

Thermofluor &#x6D4B;&#x5B9A;&#x5DF2;&#x63D0;&#x4F9B;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8BC4;&#x4F30;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7ED3;&#x6676;&#x6027;&#x80FD;&#x7ED3;&#x6784;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5B66;&#x7684;&#x5B9D;&#x8D35;&#x8D44;&#x4EA7;&#x3002;&#x6280;&#x672F;&#x597D;&#x4E3A;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5DF2;&#x8F83;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x5730;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E3A;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5411;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053;&#xFF0C;&#x4ECE; Methanococcus jannaschii CorA &#x5C55;&#x793A;&#x4E86;&#x4E00;&#x79CD;&#x57FA;&#x4E8E; Thermofluor &#x7684;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6210;&#x529F;&#x5E94;&#x7528;&#x3002;&#x4F18;&#x5316;&#x514D;&#x8D39;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x4E2D;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x662F;&#x6D53;&#x5EA6;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x5982;&#x6D53;&#x5EA6;&#x8FC7;&#x9AD8;&#x9762;&#x819C;&#x4F34;&#x70ED;&#x53D8;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;CorA &#x662F;&#x663E;&#x793A;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x4F4E; ph &#x503C;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5BF9;&#x76D0;&#x6D53;&#x5EA6;&#x76F8;&#x5BF9;&#x4E0D;&#x654F;&#x611F;&#x3002;&#x4E8C;&#x4EF7;&#x91D1;&#x5C5E;&#x79BB;&#x5B50;&#x4E5F;&#x80FD;&#x591F;&#x7A33;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x987A;&#x5E8F; Co2 + &gt; Ni2 + &gt; Mn2 + &gt; Mg2 + &gt; Ca2 +&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x8FD8;&#x663E;&#x793A;&#x4E86;&#x53BB;&#x9664;&#x7684; oligohistidine &#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x6539;&#x5584; CorA &#x7684;&#x70ED;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x3002;&#x5230;&#x5176;&#x4ED6;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x9879;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7814;&#x7A76;&#x6709;&#x5173;&#x8FD9;&#x9879;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x666E;&#x904D;&#x9002;&#x7528;&#x6027;&#x5F97;&#x51FA;&#x7684;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x3002;

&#x4ECE;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E00;&#x79CD;&#x57FA;&#x4E8E; Thermofluor &#x7684;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5; Methanococcus jannaschii CorA Mg2 + &#x8FD0;&#x8F93;&#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x8868;&#x5F81;&#x3002;

The Thermofluor assay has been a valuable asset in structural genomics, providing a high-throughput method for assessing the crystallizability of proteins. The technique has been well characterized for soluble proteins but has been less extensively described for membrane proteins. Here we show the successful application of a Thermofluor-based stability assay to an ion channel, CorA from Methanococcus jannaschii. Optimization of the concentration of free detergent within the assay was important, as excessive concentrations mask the fluorescence change associated with thermal unfolding of the protein. CorA was shown to be stabilized by low pH, but relatively insensitive to salt concentration. Divalent metal cations were also capable of stabilizing the protein, in the order Co2+>Ni2+>Mn2+>Mg2+>Ca2+. Finally, removal of the oligohistidine tag was also shown to improve the thermal stability of CorA. Conclusions are drawn from this detailed study about the general applicability of this technique to other membrane proteins.

Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay.

Le dosage Thermofluor a &#xE9;t&#xE9; un atout pr&#xE9;cieux dans la g&#xE9;nomique structurale, fournissant une m&#xE9;thode &#xE0; haut d&#xE9;bit pour l&#x26;#39;&#xE9;valuation de la cristallisation des prot&#xE9;ines. La technique a &#xE9;t&#xE9; bien caract&#xE9;ris&#xE9; pour les prot&#xE9;ines solubles, mais a &#xE9;t&#xE9; moins largement d&#xE9;crit pour les prot&#xE9;ines membranaires. Ici, nous montrons l&#x26;#39;application r&#xE9;ussie d&#x26;#39;un test de stabilit&#xE9; Thermofluor fond&#xE9;e sur un canal ionique, Cora de Methanococcus jannaschii. Optimisation de la concentration de d&#xE9;tergent libre dans le dosage &#xE9;tait important, car les concentrations excessives masquer le changement de fluorescence associ&#xE9;e &#xE0; d&#xE9;pliement thermique de la prot&#xE9;ine. Cora &#xE9;tait montr&#xE9; &#xE0; &#xEA;tre stabilis&#xE9; par un pH faible, mais relativement insensible &#xE0; la concentration en sel. Cations m&#xE9;talliques divalents ont &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; capable de stabiliser la prot&#xE9;ine, dans l&#x26;#39;ordre de Co2 +&#x26;gt; Ni2 +&#x26;gt; Mn2 +&#x26;gt; Mg 2 +&#x26;gt; Ca 2 +. Enfin, la suppression de la balise oligohistidine a &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; montr&#xE9; pour am&#xE9;liorer la stabilit&#xE9; thermique de Cora. Les conclusions sont tir&#xE9;es de cette &#xE9;tude d&#xE9;taill&#xE9;e sur l&#x26;#39;applicabilit&#xE9; g&#xE9;n&#xE9;rale de cette technique &#xE0; d&#x26;#39;autres prot&#xE9;ines membranaires.

Caract&#xE9;risation d&#x26;#39;un CorA Mg2 Canal + Transport de Methanococcus jannaschii l&#x26;#39;aide d&#x26;#39;un test de stabilit&#xE9; bas&#xE9;e sur Thermofluor

Der Thermofluor-Assay wurde ein wertvolles strukturelle Genomics, Bereitstellung einer Hochdurchsatz-Methode f&uuml;r die Bewertung der Crystallizability von Proteinen. Die Technik hat auch f&uuml;r l&ouml;sliche Proteine gepr&auml;gt aber wurde f&uuml;r Membranproteine weniger ausf&uuml;hrlich beschrieben. Hier zeigen wir die erfolgreiche Anwendung eine Thermofluor-basierte Stabilit&auml;t-Assay an einen Ionenkanal, CorA aus Methanococcus Jannaschii. Optimierung der Konzentration des freien Waschmittel innerhalb der Probe war wichtig, wie &uuml;berm&auml;&szlig;ige Konzentrationen die Fluoreszenz-&Auml;nderung zugeordnete thermische Entfaltung des Proteins maskieren. CorA war durch niedrigen pH-Wert stabilisiert werden gezeigt, aber relativ unempfindlich gegen Salzkonzentration. Bivalente Metallkationen waren auch in der Lage stabilisieren das Protein in der Reihenfolge Co2 + &gt; Ni2 + &gt; Mn2 + &gt; Mg2 + &gt; Ca2 +. Entfernung von dem Oligohistidine-Tag wurde schlie&szlig;lich auch gezeigt, um die thermische Stabilit&auml;t von CorA zu verbessern. Schlussfolgerungen werden aus dieser detaillierte Studie &uuml;ber die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik auf andere Membranproteine gezeichnet.

Charakterisierung von CorA Mg2 + Transportkanal aus Methanococcus Jannaschii unter Verwendung einer Thermofluor-basierte Stabilit&auml;t-Probe.

Il dosaggio di Thermofluor &egrave; stato un bene prezioso in Genomica strutturale, fornendo un metodo di alto-rendimento per valutare la crystallizability delle proteine. La tecnica &egrave; stata ben caratterizzata per le proteine solubili, ma &egrave; stato meno ampiamente descritta per le proteine di membrana. Qui mostriamo l&#39;applicazione di un test di stabilit&agrave; basata su Thermofluor successo per un canale ionico, CorA da 3AB jannaschii. Ottimizzazione della concentrazione del detersivo gratuito entro il dosaggio &egrave; stato importante, come una concentrazione eccessiva mascherano la variazione di fluorescenza associata termica dispiegarsi della proteina. CorA &egrave; stato indicato per essere stabilizzati con pH basso, ma relativamente insensibile alla concentrazione di sale. Bivalenti cationi metallici sono stati anche in grado di stabilizzare le proteine, nell&#39;ordine di Co2 + &amp;gt; Ni2 + &amp;gt; Mn2 + &amp;gt; Mg2 + &amp;gt; Ca2 +. Infine, rimozione del tag oligohistidine &egrave; stato anche dimostrato di migliorare la stabilit&agrave; termica di CorA. Conclusioni sono attratti da questo studio dettagliato circa l&#39;applicabilit&agrave; generale di questa tecnica di altre proteine di membrana.

Caratterizzazione di un canale di trasporto CorA Mg2 + da 3AB jannaschii utilizzando un test di stabilit&agrave; basata su Thermofluor.

Thermofluor&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306A;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x69CB;&#x9020;&#x30B2;&#x30CE;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x8CB4;&#x91CD;&#x306A;&#x8CC7;&#x7523;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x306F;&#x3088;&#x304F;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x5E83;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8A18;&#x8F09;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3001;Methanococcus jannaschii&#x304B;&#x3089;&#x30B3;&#x200B;&#x200B;&#x30FC;&#x30E9;&#x306B;Thermofluor&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x305F;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x904E;&#x5EA6;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x71B1;&#x5909;&#x6027;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x30DE;&#x30B9;&#x30AF;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x5185;&#x306E;&#x7A7A;&#x304D;&#x6D17;&#x5264;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30B3;&#x30FC;&#x200B;&#x200B;&#x30E9;&#x306F;&#x4F4E;pH&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x5869;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x53D7;&#x3051;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E8C;&#x4FA1;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x305F;&#x3081;&#x306B;CO2 +&#x26;gt; NI2 +&#x26;gt; Mn2 +&#x306E;&#x26;gt;&#x306E;Mg2 +&#x26;gt; Ca2 +&#x306E;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;oligohistidine&#x30BF;&#x30B0;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x306F;&#x3001;&#x30B3;&#x30FC;&#x30E9;&#x306E;&#x71B1;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x3092;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x7D50;&#x8AD6;&#x306F;&#x3001;&#x4ED6;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3078;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x9069;&#x7528;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x7814;&#x7A76;&#x304B;&#x3089;&#x63CF;&#x304B;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Thermofluor&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;Methanococcus Jannaschii&#x304B;&#x3089;&#x30B3;&#x200B;&#x200B;&#x30FC;&#x30E9;Mg2 +&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x8A55;&#x4FA1;

Thermofluor &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xBC29;&#xBC95; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; crystallizability&#xB97C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xAD6C;&#xC870; &#xC720;&#xC804;&#xCCB4;&#xD559;&#xC758; &#xADC0;&#xC911; &#xD55C; &#xC790;&#xC0B0;&#xC774; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC798; &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB35C; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD558; &#xAC8C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC124;&#xBA85; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110;, Methanococcus jannaschii&#xC5D0;&#xC11C; &#xCF54; &#xB77C;&#xC5D0; Thermofluor &#xAE30;&#xBC18; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xACFC;&#xB3C4; &#xD55C; &#xB18D;&#xB3C4; &#xB9C8;&#xC2A4;&#xD06C;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC5F4; &#xC804;&#xAC1C;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xD615;&#xAD11; &#xBCC0;&#xD654; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBB34;&#xB8CC; &#xC138;&#xC81C;&#xC758; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC758; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654;, &#xC911;&#xC694; &#xD588;&#xB2E4;. &#xCF54; &#xB77C; &#xB0AE;&#xC740; Ph&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xB420; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC18C;&#xAE08; &#xB18D;&#xB3C4;&#xAC00; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBB34;&#xC2EC; &#xD588;&#xB2E4;. Divalent &#xAE08;&#xC18D; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xB610;&#xD55C; &#xC21C;&#xC11C;&#xB85C; Co2 + &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD588;&#xB2E4; &amp;gt; Ni2 + &amp;gt; Mn2 + &amp;gt; Mg2 + &amp;gt; Ca2 +. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, oligohistidine &#xD0DC;&#xADF8;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70; &#xB610;&#xD55C; &#xCF54; &#xB77C;&#xC758; &#xC5F4; &#xC548;&#xC815;&#xC131;&#xC744; &#xAC1C;&#xC120; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xACB0;&#xB860;&#xC740; &#xB2E4;&#xB978; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC774; &#xAE30;&#xBC95;&#xC758; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xC801;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C1;&#xC138;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB824;&#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Methanococcus jannaschii Thermofluor &#xAE30;&#xBC18; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCF54; &#xB77C; Mg2 + &#xC804;&#xC1A1; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D;.

El ensayo Thermofluor ha sido un activo valioso en la gen&#xF3;mica estructural, proporcionando un m&#xE9;todo de alto rendimiento para evaluar la cristalizaci&#xF3;n de las prote&#xED;nas. La t&#xE9;cnica ha sido bien caracterizado para las prote&#xED;nas solubles, pero ha sido menos ampliamente descrito para las prote&#xED;nas de membrana. Aqu&#xED; se muestra la aplicaci&#xF3;n con &#xE9;xito de un ensayo de estabilidad Thermofluor basado en un canal de iones, Cora de Methanococcus jannaschii. Optimizaci&#xF3;n de la concentraci&#xF3;n de detergente libre dentro del ensayo fue importante, ya que las concentraciones excesivas enmascarar el cambio de fluorescencia asociada con t&#xE9;rmica desdoblamiento de la prote&#xED;na. Cora fue demostrado ser estabilizado por un pH bajo, pero relativamente insensible a la concentraci&#xF3;n de sal. Cationes met&#xE1;licos divalentes tambi&#xE9;n fueron capaces de estabilizar la prote&#xED;na, en el orden de Co2 +&#x26;gt; Ni2 +&#x26;gt; Mn2 +&#x26;gt; Mg2 +&#x26;gt; Ca2 +. Por &#xFA;ltimo, la eliminaci&#xF3;n de la etiqueta oligohistidine se muestra tambi&#xE9;n para mejorar la estabilidad t&#xE9;rmica de Cora. Las conclusiones se extraen de este estudio detallado sobre la aplicaci&#xF3;n general de esta t&#xE9;cnica a otras prote&#xED;nas de membrana.

Caracterizaci&#xF3;n de una CorA Mg2 Canal + Transporte desde Methanococcus jannaschii El uso de un ensayo de estabilidad basada en Thermofluor

&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684; extra-membranous &#x57DF;&#x7684; tetrameric &#x5185;&#x5FC3;&#x6574;&#x6D41; Kir2.1 &#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; (Kir2.1NC(4)) &#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x819C;&#x9E1F;&#x82F7;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x86CB;&#x767D; PSD 95 &#x5DF2;&#x7ECF;&#x7814;&#x7A76;&#x900F;&#x5C04;&#x7535;&#x955C;&#x5728;&#x6D88;&#x6781;&#x7684;&#x6C61;&#x70B9;&#x3002;&#x5728;&#x5BF9;&#x5E94;&#x4E8E; 1&#xFF1A; 1 &#x590D;&#x6742;&#xFF0C;&#x5927;&#x7684;&#x81EA;&#x6210;&#x4E00;&#x4F53;&#x56DB;&#x5206;&#x4F53;&#x7684;&#x94FE;&#x63A5;&#x7684;&#x901A;&#x9053;&#x57DF;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x548C;&#x6269;&#x5C55;&#x94FE;&#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x7167;&#x7247;&#x51FA;&#x73B0;&#x4E86;&#x4E09;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x6A21;&#x578B;&#x6D3E;&#x751F;&#x81EA;&#x5C0F;&#x89D2; x &#x5C04;&#x7EBF;&#x6563;&#x5C04;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#x54EA;&#x4E9B;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7ED3;&#x6784;&#x4ECE; x &#x5C04;&#x7EBF;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x548C;&#x6838;&#x78C1;&#x5171;&#x632F;&#x7814;&#x7A76;&#x5B9A;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E2A;&#x7C92;&#x5B50;&#x5206;&#x6790;&#x4FE1;&#x5C01;&#x53EF;&#x4EE5;&#x89E3;&#x6790;&#x4E3A; Kir2.1NC (4)&#xFF1A; PSD 95 &#x590D;&#x6742;&#x548C;&#x56DB;&#x5206;&#x4F53;&#x7684;&#x8FD9;&#x80A1; &#xFF08;Kir2.1NC(4):PSD-95)(4)&#x3002;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x56DB;&#x5206;&#x4F53;&#x663E;&#x793A; Kir2.1 &#x80DE;&#x8D28;&#x57DF;&#x7684;&#x5BC6;&#x5207;&#x8054;&#x7CFB;&#x548C;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684; PSD 95 &#x81EA;&#x7EC4;&#x88C5;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x805A;&#x7C7B;&#x5206;&#x6790;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6E20;&#x9053;&#x3002;

&#x81EA;&#x4E3B;&#x7684;&#x5927;&#x4F1A;&#x548C;&#x5185;&#x5FC3;&#x7EA0;&#x6B63;&#x4E0E; PSD 95 Kir2.1 &#x94BE;&#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x80DE;&#x8D28;&#x57DF;&#x7684;&#x805A;&#x7C7B;&#x3002;

The interaction of the extra-membranous domain of tetrameric inwardly rectifying Kir2.1 ion channels (Kir2.1NC(4)) with the membrane associated guanylate kinase protein PSD-95 has been studied using Transmission Electron Microscopy in negative stain. Three types of complexes were observed in electron micrographs corresponding to a 1:1 complex, a large self-enclosed tetrad complex and extended chains of linked channel domains. Using models derived from small angle X-ray scattering experiments in which high resolution structures from X-ray crystallographic and Nuclear Magnetic Resonance studies are positioned, the envelopes from single particle analysis can be resolved as a Kir2.1NC(4):PSD-95 complex and a tetrad of this unit (Kir2.1NC(4):PSD-95)(4). The tetrad complex shows the close association of the Kir2.1 cytoplasmic domains and the influence of PSD-95 mediated self-assembly on the clustering of these channels.

Self-directed assembly and clustering of the cytoplasmic domains of inwardly rectifying Kir2.1 potassium channels on association with PSD-95.

L&#39;interaction du domaine extra-membranous du t&eacute;tram&egrave;re vers l&#39;int&eacute;rieur le canaux ioniques de Kir2.1 (Kir2.1NC(4)) avec la membrane associ&eacute;e guanylate kinase prot&eacute;ine PSD-95 a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute;e &agrave; l&#39;aide de la microscopie &eacute;lectronique &agrave; Transmission en colorant n&eacute;gatif. Trois types de complexes ont &eacute;t&eacute; observ&eacute;s en microscopie &eacute;lectronique correspondant &agrave; un complexe 1:1, une t&eacute;trade d&#39;agencer grande cha&icirc;nes complexes et &eacute;tendus de domaines canal li&eacute;. &Agrave; l&#39;aide de mod&egrave;les provenant des exp&eacute;riences de diffusion des rayons x de petit angle dans quelles structures de haute r&eacute;solution de diffraction et r&eacute;sonance magn&eacute;tique nucl&eacute;aire est plac&eacute;s, les enveloppes de l&#39;analyse de la particule peuvent &ecirc;tre r&eacute;solus comme un Kir2.1NC (4): complexe de PSD-95 et une t&eacute;trade de cet appareil (Kir2.1NC(4):PSD-95)(4). La t&eacute;trade complexe montre l&#39;association &eacute;troite des domaines cytoplasmiques Kir2.1 et l&#39;influence de PSD-95 m&eacute;di&eacute;e par auto-assemblage sur le regroupement de ces canaux.

Assembl&eacute;e autog&eacute;r&eacute;e et le regroupement des domaines cytoplasmiques de vers l&#39;int&eacute;rieur le canaux potassiques Kir2.1 sur la liaison avec le PSD-95.

Die Interaktion der extra-membranous Dom&auml;ne des tetrameren innerlich zur Berichtigung der Kir2.1-Ionenkan&auml;le (Kir2.1NC(4)) mit den verbundenen Guanylate Kinase Membranprotein PSD-95 wurde untersucht mit Transmissionselektronenmikroskopie in negative Fleck. Drei Arten von komplexen wurden in Elektron-Aufnahmen entspricht eine 1:1 Komplex, eine gro&szlig;e selbstbegrenzenden Vierergruppe komplexe und l&auml;ngere Ketten verkn&uuml;pften Kanal Domains beobachtet. Modelle aus abgeleiteten kleiner Winkel R&ouml;ntgen Streuung Experimente in die hochaufl&ouml;sende Strukturen von x-ray kristallographische und Kernspinresonanz-Studien sind positioniert, die Umschl&auml;ge aus einzelnen Partikelanalyse k&ouml;nnen als ein Kir2.1NC gel&ouml;st werden (4): PSD-95-komplex und eine Vierergruppe dieser Einheit (Kir2.1NC(4):PSD-95)(4). Die komplexe Vierergruppe zeigt die enge Beziehung der Kir2.1 zytoplasmatischen Dom&auml;nen und der Einfluss der PSD-95 vermittelt Selbstkonfektion auf das clustering dieser Kan&auml;le.

Selbstgesteuertes Montage und clustering der cytoplasmatische Dom&auml;nen innerlich zur Berichtigung der Kir2.1 Kaliumkan&auml;le &uuml;ber Assoziation mit PSD-95.

L&#39;interazione del dominio extra-membranous di tetramerica interiormente che rettifica sono canali ionici (Kir2.1NC(4)) con la membrana associato guanilato chinasi di proteina PSD-95 &egrave; stata studiata mediante microscopia elettronica della trasmissione nella macchia negativa. Tre tipi di complessi sono stati osservati nel microscopio corrispondente a un 1:1 complesso, una grande tetrade compatto estese e complesse catene di domini canale collegato. Utilizzando modelli derivati da esperimenti di dispersione di raggi x piccolo angolo in cui strutture ad alta risoluzione da cristallografia a raggi x e vengono posizionati gli studi di risonanza magnetica nucleare, le buste dall&#39;analisi della singola particella possono essere risolte come un Kir2.1NC (4): complesso di PSD-95 e una tetrade di questa unit&agrave; (Kir2.1NC(4):PSD-95)(4). La tetrade complessa Mostra la stretta associazione dei domini citoplasmatici sono e l&#39;influenza di PSD-95 auto-assemblaggio mediato sul clustering di questi canali.

Auto-assemblaggio e clustering dei domini citoplasmatici di interiormente che rettifica sono canali di potassio in associazione con PSD-95.

Extra-membranous &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E; 4 &#x91CF;&#x4F53; (Kir2.1NC(4)) &#x95A2;&#x9023;&#x819C;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30EB;&#x9178;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; PSD 95 &#x3068;&#x900F;&#x904E;&#x578B;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x8CA0;&#x306E;&#x6C5A;&#x308C;&#x3067;&#x7814;&#x7A76;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; Kir2.1 &#x30A4;&#x30AA;&#x30F3; &#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x5185;&#x5411;&#x304D;&#x6574;&#x6D41;&#x6027;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x932F;&#x4F53;&#x306E; 3 &#x7A2E;&#x985E;&#x3001;1:1 &#x306B;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5927;&#x98A8;&#x5442; &#xFF06; &#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30C9;&#x8907;&#x96D1;&#x3068;&#x62E1;&#x5F35;&#x306E;&#x30C1;&#x30A7;&#x30FC;&#x30F3; &#x30EA;&#x30F3;&#x30AF; &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3069;&#x306E;&#x9AD8;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x69CB;&#x9020;&#x4F53; x &#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x304B;&#x3089;&#x306E; x &#x7DDA;&#x5C0F;&#x89D2;&#x6563;&#x4E71;&#x5B9F;&#x9A13;&#x304B;&#x3089;&#x6D3E;&#x751F;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6838;&#x78C1;&#x6C17;&#x5171;&#x9CF4;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x914D;&#x7F6E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3001;&#x5358;&#x7C92;&#x5B50;&#x89E3;&#x6790;&#x304B;&#x3089;&#x5C01;&#x7B52;&#x3092; Kir2.1NC &#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3067;&#x304D;&#x308B; (4): PSD 95 &#x30B3;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x3053;&#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; &#xFF08;Kir2.1NC(4):PSD-95)(4) &#x306E;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30C9;.PSD 95 &#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x306F;&#x3001;&#x81EA;&#x5DF1;&#x306E;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF; &#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x5A92;&#x4ECB;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30C9;&#x8907;&#x96D1;&#x306A; Kir2.1 &#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x81EA;&#x5DF1;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3068; Kir2.1 &#x30AB;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0; &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB; PSD 95 &#x3068;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x306B;&#x5185;&#x5411;&#x304D;&#x6574;&#x6D41;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF; &#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xB0B4;&#xC2EC; &#xC815;&#xB958; Kir2.1 &#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110; (Kir2.1NC(4)) &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xAD00;&#xB828; guanylate &#xB2C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; PSD-95&#xC640; &#xACF5;&#xBD80; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4; &#xC804;&#xC1A1; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC5BC;&#xB8E9;&#xC5D0; tetrameric&#xC758; extra-membranous &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;. &#xB2E8;&#xC9C0; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC720;&#xD615;&#xC758; 1:1 &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD558; &#xACE0;, &#xB300;&#xD615; self-enclosed tetrad &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xCC44;&#xB110; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD558; &#xACE0; &#xD655;&#xC7A5; &#xB41C; &#xCCB4;&#xC778;&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xD558;&#xB294; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. Crystallographic x-&#xB808;&#xC774;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC791;&#xC740; &#xAC01; x &#xC120; &#xC0B0;&#xB780; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBC0F; &#xD575; &#xC790;&#xAE30; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xBC30;&#xCE58; &#xD558;&#xB294;, &#xB2E8;&#xC77C; &#xC785;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD09;&#xD22C;&#xB97C; kir2.1nc&#xB85C; &#xD574;&#xACB0;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; (4): PSD 95 &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD558; &#xACE0;&#xC774; &#xB2E8;&#xC704; (Kir2.1NC(4):PSD-95)(4) tetrad. &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; tetrad &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4; Kir2.1 &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xAC00;&#xAE4C;&#xC6B4; &#xD611;&#xD68C;&#xC640; PSD-95&#xC758; &#xC601;&#xD5A5;&#xC774;&#xC774; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xC790;&#xAE30; &#xC870;&#xB9BD; &#xC911;&#xC7AC;.

&#xC790;&#xAE30; &#xC870;&#xB9BD;&#xACFC; &#xB0B4;&#xC2EC; PSD-95&#xC640; &#xD611;&#xD68C;&#xC5D0; Kir2.1 &#xCE7C;&#xB968; &#xCC44;&#xB110; &#xC870;&#xC815;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130;&#xB9C1;.

La interacci&oacute;n del dominio extra-membranous de tetram&eacute;rica interiormente rectificar Kir2.1 canales de iones (Kir2.1NC(4)) con la membrana asociada guanilato quinasa prote&iacute;na PSD-95 se ha estudiado mediante microscop&iacute;a electr&oacute;nica de transmisi&oacute;n en mancha negativa. Se observaron tres tipos de complejos micrograf&iacute;as correspondiente a un 1:1 complejo, una t&eacute;trada encontrar&aacute; grande cadenas complejas y extendidas de dominios canal vinculado. Utilizando modelos derivados de experimentos de dispersi&oacute;n de rayos x de &aacute;ngulo peque&ntilde;o en que las estructuras de alta resoluci&oacute;n de cristalogr&aacute;fica de rayos x y estudios de resonancia magn&eacute;tica Nuclear se colocan, los sobres de an&aacute;lisis sola part&iacute;cula pueden resolverse como un Kir2.1NC (4): complejo de PSD-95 y una t&eacute;trada de esta unidad (Kir2.1NC(4):PSD-95)(4). La t&eacute;trada compleja muestra la estrecha relaci&oacute;n de los dominios citoplasm&aacute;ticos de Kir2.1 y la influencia de PSD-95 autoensamblaje mediado en el agrupamiento de estos canales.

Asamblea autodirigido y agrupamiento de los dominios citoplasm&aacute;ticos de rectificar interiormente Kir2.1 canales de potasio en asociaci&oacute;n con PSD-95.

&#x56CA;&#x6027;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x5316;&#x5F71;&#x54CD;&#x7EA6;&#x5728; 2500&#x5E74;&#x6D3B;&#x4EA7;&#x5A74;&#x513F;&#x4E2D;&#x7684; 1 &#x548C;&#x6D89;&#x53CA;&#x7531;&#x4E8E;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x79F0;&#x4E3A;&#x56CA;&#x6027;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x5316;&#x8DE8;&#x819C;&#x7535;&#x5BFC;&#x8C03;&#x8282;&#x5668; (CFTR) &#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x901A;&#x9053;&#x8DE8;&#x819C;&#x7684;&#x6C2F;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x91CF;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76; CFTR &#x7ED3;&#x6784;&#x3002;&#x6570;&#x636E;&#x4E0E;&#x73B0;&#x6709;&#x7684;&#x5176;&#x5B83;&#x4E09;&#x78F7;&#x9178;&#x817A;&#x82F7;&#x7ED3;&#x5408;&#x76D2;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x4F5C;&#x4E86;&#x6BD4;&#x8F83;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5728;&#x5916;&#x5411;&#x9762;&#x4E34;&#x72B6;&#x6001;&#x7684;&#x4F53;&#x73B0;&#x4E0E;&#x76F8;&#x4F3C;&#x597D;&#x7279;&#x8272;&#x7684; Sav1866 &#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0; CFTR &#x6620;&#x5C04;&#x4E2D;&#xFF0C;Sav1866&#xFF0C;&#x4E0D;&#x5360;&#x4E86;&#x76D1;&#x7BA1;&#x7684;&#x533A;&#x57DF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x901A;&#x9053;&#x95F8;&#x95E8;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x7684;&#x533A;&#x57DF;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x5206;&#x6790;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x88AB;&#x8F85;&#x52A9;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x5BF9;&#x79F0;&#x6027;&#x4E0D;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x4E8B;&#x5B9E;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86;&#x88C5;&#x7684; Sav1866 &#x6A21;&#x578B;&#x4E2D;&#x7684;&#x533A;&#x57DF;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x5730;&#x56FE;&#x4E2D;&#x4E22;&#x5931;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#x5728; CFTR &#x7D0A;&#x4E71;&#x6216;&#x4EE5;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x7684;&#x533A;&#x57DF;&#x76F8;&#x6BD4; Sav1866&#x3002;&#x8FD9;&#x8868;&#x793A;&#x7684; N &#x548C; C &#x7684;&#x603B;&#x7AD9;&#xFF0C;&#x9664;&#x4E86; CFTR&#xFF0C;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x7ED3;&#x675F;&#x8DE8;&#x819C;&#x87BA;&#x65CB; 5/11 &#x548C;&#x5176;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x5FAA;&#x73AF;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x90E8;&#x5206;&#x65E0;&#x5E8F; &#xFF08;&#x6216;&#x6216;&#x8005;&#x6240;&#x5728;&#x5730;&#xFF09;&#x3002;

&#x56CA;&#x6027;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x5316;&#x8DE8;&#x819C;&#x7535;&#x5BFC;&#x8C03;&#x8282;&#x5668; (CFTR)&#xFF1A; &#x4E09;&#x7EF4;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x901A;&#x9053;&#x95E8;&#x3002;

Cystic fibrosis affects about 1 in 2500 live births and involves loss of transmembrane chloride flux due to a lack of a membrane protein channel termed the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). We have studied CFTR structure by electron crystallography. The data were compared with existing structures of other ATP-binding cassette transporters. The protein was crystallized in the outward facing state and resembled the well characterized Sav1866 transporter. We identified regions in the CFTR map, not accounted for by Sav1866, which were potential locations for the regulatory region as well as the channel gate. In this analysis, we were aided by the fact that the unit cell was composed of two molecules not related by crystallographic symmetry. We also identified regions in the fitted Sav1866 model that were missing from the map, hence regions that were either disordered in CFTR or differently organized compared with Sav1866. Apart from the N and C termini, this indicated that in CFTR, the cytoplasmic end of transmembrane helix 5/11 and its associated loop could be partly disordered (or alternatively located).

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR): three-dimensional structure and localization of a channel gate.

La fibrose kystique affecte environ 1 personne sur 2500 naissances vivantes et implique la perte de flux de chlorure transmembranaire en raison de l&#x26;#39;absence d&#x26;#39;une prot&#xE9;ine membranaire appel&#xE9;e canal de l&#x26;#39;organisme de r&#xE9;glementation transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR). Nous avons &#xE9;tudi&#xE9; la structure CFTR par cristallographie &#xE9;lectronique. Les donn&#xE9;es ont &#xE9;t&#xE9; compar&#xE9;es avec les structures existantes d&#x26;#39;autres transporteurs ATP-binding cassette. La prot&#xE9;ine a &#xE9;t&#xE9; cristallis&#xE9;e dans l&#x26;#39;&#xE9;tat tourn&#xE9; vers l&#x26;#39;ext&#xE9;rieur et ressemblait le bien caract&#xE9;ris&#xE9; Sav1866 transporteur. Nous avons identifi&#xE9; les r&#xE9;gions dans la carte CFTR, pas pris en compte par Sav1866, qui &#xE9;taient des emplacements possibles pour la r&#xE9;gion de r&#xE9;gulation ainsi que la porte du canal. Dans cette analyse, nous avons &#xE9;t&#xE9; aid&#xE9;s par le fait que la cellule unit&#xE9; &#xE9;tait compos&#xE9;e de deux mol&#xE9;cules ne sont pas li&#xE9;s par sym&#xE9;trie cristallographique. Nous avons &#xE9;galement identifi&#xE9; des r&#xE9;gions dans le mod&#xE8;le ajust&#xE9; Sav1866 qui manquaient &#xE0; la carte, d&#x26;#39;o&#xF9; les r&#xE9;gions qui ont &#xE9;t&#xE9; soit d&#xE9;sordonn&#xE9; de la CFTR, ou diff&#xE9;remment organis&#xE9;e contre Sav1866. Mis &#xE0; part le terminus N et C, ce qui indiquait que la CFTR, la fin cytoplasmique de h&#xE9;lice transmembranaire 5/11 et sa boucle associ&#xE9; pourrait &#xEA;tre en partie d&#xE9;sordonn&#xE9;e (ou bien situ&#xE9;).

Le r&#xE9;gulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR): Structure tridimensionnelle et localisation d&#x26;#39;un porte Manche

Zystische Fibrose betrifft etwa 1 in 2500 Lebendgeburten und einen Verlust Transmembran-Chlorid Flux aufgrund des Fehlens eines Membran-Protein-Kanals der Cystic Fibrosis transmembrane Conductance Regulator (CFTR) bezeichnet. Wir haben CFTR-Struktur von Elektron-Kristallographie untersucht. Die Daten wurden mit den bestehenden Strukturen der anderen ATP verbindliche Kassette Transporter verglichen. Das Protein wurde kristallisiert in den nach au&szlig;en gerichteten Zustand und &auml;hnelten den gut gekennzeichneten Sav1866-Transporter. Wir identifizieren die Regionen in der CFTR-Karte, nicht von Sav1866, entfielen die potenzielle Standorte f&uuml;r die regulatorischen Region sowie das Kanal-Tor waren. In dieser Analyse wurden wir durch die Tatsache unterst&uuml;tzt, dass die Elementarzelle von zwei Molek&uuml;len, die nicht im Zusammenhang von kristallographische Symmetrie komponiert wurde. Wir auch Regionen in das angepasste Modell der Sav1866, die aus der Karte fehlten identifiziert, also Regionen, die entweder in CFTR ungeordnet oder anders organisiert wurden, verglichen mit Sav1866. Abgesehen von der N und C-Termini erkl&auml;rt dies, im CFTR, zellplasmatische Ende Transmembran-Helix 5/11 und die damit verbundenen Loop teilweise ungeordnet (oder alternativ gelegen) sein k&ouml;nnte.

Der Cystic Fibrosis transmembrane Conductance Regulator (CFTR): dreidimensionale Struktur und Lokalisierung von einem Kanal-Tor.

La fibrosi cistica colpisce circa 1 2500 nati vivi e comporta la perdita del flusso transmembrana cloruro per mancanza di un canale di proteine di membrana definito il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica (CFTR). Abbiamo studiato la struttura di CFTR di cristallografia di elettroni. I dati sono stati confrontati con le strutture esistenti di altri trasportatori cassetta ATP-binding. La proteina &egrave; stata cristallizzata nello stato rivolto verso l&#39;esterno e somigliava al trasportatore Sav1866 ben caratterizzato. Abbiamo identificato regioni nella mappa del CFTR, non contabilizzati da Sav1866, che erano potenziali posizioni per la regione normativa cos&igrave; come il cancello del canale. In questa analisi, noi eravamo aiutati dal fatto che l&#39;unit&agrave; della cella era composto da due molecole non correlati da simmetria cristallografico. Abbiamo anche individuato regioni nel modello Sav1866 adattato che mancavano dalla mappa, quindi regioni che furono disordinati nel CFTR o diversamente organizzati rispetto al Sav1866. Oltre i termini di N e C, questo indicato che nel CFTR, fine citoplasmatica del transmembrane helix 5/11 e relativo ciclo associato potrebbe essere parzialmente disordinati (o in alternativa trova).

Il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica (CFTR): struttura tridimensionale e la localizzazione di un cancello di canale.

&#x56A2;&#x80DE;&#x6027;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x75C7;&#x306F;&#x3001;2500&#x306E;&#x51FA;&#x751F;&#x306B;&#x7D04;1&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3057;&#x3001;&#x539F;&#x56E0;&#x56A2;&#x80DE;&#x6027;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x75C7;&#x819C;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x5236;&#x5FA1;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;CFTR&#xFF09;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8CAB;&#x901A;&#x5869;&#x5316;&#x7269;&#x30D5;&#x30E9;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x3092;&#x542B;&#x307F;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x96FB;&#x5B50;&#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x5B66;&#x306B;&#x3088;&#x308B;CFTR&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x3066;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x4ED6;&#x306E;ATP-&#x7D50;&#x5408;&#x30AB;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x65E2;&#x5B58;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x5916;&#x5074;&#x3092;&#x5411;&#x304F;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x5341;&#x5206;&#x306B;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;Sav1866&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x4F3C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;CFTR&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x3067;&#x9818;&#x57DF;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x9818;&#x57DF;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x5834;&#x6240;&#x3060;&#x3063;&#x305F;Sav1866&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8003;&#x616E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x30BB;&#x30EB;&#x306F;&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306E;&#x306A;&#x3044;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x304B;&#x3089;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x52A9;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x6545;&#x306B;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x304B;&#x3089;&#x6B20;&#x843D;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30C8;Sav1866&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3069;&#x3061;&#x3089;CFTR&#x306E;&#x4E71;&#x308C;&#x304B;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5225;&#x306E;Sav1866&#x3068;&#x6BD4;&#x200B;&#x200B;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x7D44;&#x7E54;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9818;&#x57DF;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x96E2;&#x308C;&#x3066;N&#x304A;&#x3088;&#x3073;C&#x672B;&#x7AEF;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;CFTR&#x3001;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;5&#x6708;11&#x65E5;&#x3068;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306F;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306B;&#x7121;&#x79E9;&#x5E8F;&#x306A;&#xFF08;&#x3042;&#x308B;&#x3044;&#x306F;&#x4F4D;&#x7F6E;&#xFF09;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;

&#x56A2;&#x80DE;&#x6027;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x75C7;&#x819C;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x5236;&#x5FA1;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;CFTR&#xFF09;&#xFF1A;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#xB7;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;&#x4E09;&#x6B21;&#x5143;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;

&#xB0AD; &#xC131; &#xC12C;&#xC720; &#xC99D; 2500 &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xCD9C;&#xC0DD;&#xC5D0; &#xC57D; 1&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xB0AD; &#xC131; &#xC12C;&#xC720; &#xC99D; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130; (CFTR) &#xB418; &#xB098; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xBD80;&#xC871;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC5FC;&#xD654; &#xD50C;&#xB7ED;&#xC2A4;&#xC758; &#xC190;&#xC2E4; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC804;&#xC790; &#xACB0;&#xC815;&#xD559;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; CFTR &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xB2E4;&#xB978; ATP &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xCE74;&#xC138;&#xD2B8; &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30;&#xC758; &#xAE30;&#xC874; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; &#xBC14;&#xAE65;&#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9C8;&#xC8FC; &#xBCF4;&#xB294; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xC2DC;&#xD0A4;&#xB294; &#xD588;&#xB2E4; &#xC798; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC774; Sav1866 &#xC804;&#xC1A1; &#xB2EE;&#xC740;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xCC44;&#xB110; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8; &#xBC0F; &#xADDC;&#xC81C; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC704;&#xCE58; &#xD588;&#xB2E4; &#xD558;&#xC9C0; Sav1866&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCC28;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; CFTR &#xB9F5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC601;&#xC5ED; &#xC2DD;&#xBCC4;. &#xC774; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; crystallographic &#xB300;&#xCE6D;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xB828;&#xC774; &#xC5C6;&#xB294; &#xB450; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xB2E8;&#xC704; &#xC140; &#xAD6C;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;&#xB294; &#xC0AC;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC8FC; &#xC5C8; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB610;&#xD55C; &#xC9C0;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB204;&#xB77D; &#xB41C; &#xC7A5;&#xCC29;&#xB41C; Sav1866 &#xBAA8;&#xB378;&#xC758; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4;, &#xC9C0;&#xC5ED; &#xC911; CFTR &#xBB34;&#xC9C8;&#xC11C; &#xB610;&#xB294; &#xB2E4;&#xB974;&#xAC8C; &#xAD6C;&#xC131; &#xB41C; sav1866&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558;&#xB294; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;. N &#xBC0F; C &#xD14C;&#xB974;&#xBBF8;&#xB2C8; &#xB5A8;&#xC5B4;&#xC838;&#xC774; CFTR&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xB098;&#xC120; 5/11 &#xB05D;&#xC758; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xB8E8;&#xD504;&#xB294; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBB34;&#xC9C8;&#xC11C; (&#xB610;&#xB294; &#xC591;&#xC790; &#xD0DD;&#xC77C;&#xB85C; &#xC704;&#xCE58;) &#xB420; &#xC218; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB0AD; &#xC131; &#xC12C;&#xC720; &#xC99D; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130; (CFTR): 3 &#xCC28;&#xC6D0; &#xAD6C;&#xC870; &#xBC0F; &#xCC44;&#xB110; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;.

La fibrosis qu&#xED;stica afecta a aproximadamente 1 de cada 2500 nacidos vivos y consiste en la p&#xE9;rdida del flujo de cloruro de transmembrana debido a la falta de un canal de prote&#xED;na de membrana denominada fibrosis qu&#xED;stica transmembrana regulador de la conductancia (CFTR). Hemos estudiado la estructura de CFTR por cristalograf&#xED;a de electrones. Los datos se compararon con las estructuras existentes de otros transportadores de cassette de uni&#xF3;n al ATP. La prote&#xED;na se cristaliz&#xF3; en el estado exteriores y se asemejaba a la bien caracterizada Sav1866 transportador. Se identificaron las regiones en el mapa de CFTR, no explica por Sav1866, que son lugares potenciales para la regi&#xF3;n reguladora, as&#xED; como la puerta del canal. En este an&#xE1;lisis, fueron ayudados por el hecho de que la celda unidad se compone de dos mol&#xE9;culas que no est&#xE1;n relacionadas por la simetr&#xED;a cristalogr&#xE1;fica. Tambi&#xE9;n se identificaron las regiones en el modelo ajustado Sav1866 que faltaban en el mapa, por lo tanto, las regiones que estaban desordenadas, ya sea en CFTR o de manera diferente en comparaci&#xF3;n con Sav1866 organizada. Aparte de la terminales N y C, esto indica que en CFTR, el extremo citopl&#xE1;smico de h&#xE9;lice transmembrana 5/11 y su bucle asociado podr&#xED;a ser parcialmente desordenado (o, alternativamente, localizado).

Liam O'Ryan

Faculty of Life Sciences

University of Manchester

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Liam O'Ryan

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Faculty of Life Sciences

University of Manchester

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Faculty of Life Sciences