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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Massachusetts Institute of Technology

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness in the elderly. In its severest form, choroidal neovessels breach the macular Bruch's membrane, an extracellular matrix compartment comprised of elastin and collagen laminae, and grow into the retina. We sought to determine whether structural properties of the elastic lamina (EL) correspond to the region of the macula that is predilected toward degeneration in AMD. Morphometric assessment of the macular and extramacular regions of 121 human donor eyes, with and without AMD, revealed a statistically significant difference in both the integrity (P < 0.0001) and thickness (P < 0.0001) of the EL between the macular and extramacular regions in donors of all ages. The EL was three to six times thinner and two to five times less abundant in the macula than in the periphery. The integrity of the macular EL was significantly lower in donors with early-stage AMD (P = 0.028), active choroidal neovascularization (P = 0.020), and disciform scars (P = 0.003), as compared to unaffected, age-matched controls. EL thickness was significantly lower only in individuals with disciform scars (P = 0.008). The largest gaps in macular EL integrity were significantly larger in all categories of AMD (each P < 0.0001), as compared to controls. EL integrity, thickness, and gap length in donors with geographic atrophy did not differ from those of controls. These structural properties of the macular EL correspond spatially to the distribution of macular lesions associated with AMD and may help to explain why the macula is more susceptible to degenerative events that occur in this disease.

Decreased thickness and integrity of the macular elastic layer of Bruch's membrane correspond to the distribution of lesions associated with age-related macular degeneration.

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&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x9677;&#x5370;&#x548C; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x5206;&#x6790;&#x4F7F;&#x7528;&#x5FAE;&#x5B54;&#x9635;&#x5217;&#x3002;

With a direct link to cancer, aging, and heritable diseases as well as a critical role in cancer treatment, the importance of DNA damage is well-established. The intense interest in DNA damage in applications ranging from epidemiology to drug development drives an urgent need for robust, high throughput, and inexpensive tools for objective, quantitative DNA damage analysis. We have developed a simple method for high throughput DNA damage measurements that provides information on multiple lesions and pathways. Our method utilizes single cells captured by gravity into a microwell array with DNA damage revealed morphologically by gel electrophoresis. Spatial encoding enables simultaneous assays of multiple experimental conditions performed in parallel with fully automated analysis. This method also enables novel functionalities, including multiplexed labeling for parallel single cell assays, as well as DNA damage measurement in cell aggregates. We have also developed 24- and 96-well versions, which are applicable to high throughput screening. Using this platform, we have quantified DNA repair capacities of individuals with different genetic backgrounds, and compared the efficacy of potential cancer chemotherapeutics as inhibitors of a critical DNA repair enzyme, human AP endonuclease. This platform enables high throughput assessment of multiple DNA repair pathways and subpathways in parallel, thus enabling new strategies for drug discovery, genotoxicity testing, and environmental health.

Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.

Avec un lien direct vers le cancer, le vieillissement et les maladies h&#xE9;r&#xE9;ditaires ainsi que d&#x26;#39;un r&#xF4;le critique dans le traitement du cancer, l&#x26;#39;importance de dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN est bien &#xE9;tabli. Le vif int&#xE9;r&#xEA;t dans les l&#xE9;sions de l&#x26;#39;ADN dans des applications allant de l&#x26;#39;&#xE9;pid&#xE9;miologie au d&#xE9;veloppement de m&#xE9;dicaments entra&#xEE;ne un besoin urgent de robustesse, un d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9;, et des outils peu co&#xFB;teux pour objectif, analyse de l&#x26;#39;ADN des dommages quantitative. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une m&#xE9;thode simple pour des mesures &#xE0; haut d&#xE9;bit dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN qui fournit des informations sur les l&#xE9;sions multiples et les voies. Le proc&#xE9;d&#xE9; utilise des cellules individuelles captur&#xE9;es par gravit&#xE9; dans une matrice de micropuits avec alt&#xE9;ration de l&#x26;#39;ADN montr&#xE9; morphologiquement par &#xE9;lectrophor&#xE8;se sur gel. Codage spatial permet dosages simultan&#xE9;s de plusieurs conditions exp&#xE9;rimentales r&#xE9;alis&#xE9;es en parall&#xE8;le avec l&#x26;#39;analyse enti&#xE8;rement automatis&#xE9;e. Cette m&#xE9;thode permet &#xE9;galement de nouvelles fonctionnalit&#xE9;s, y compris l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage multiplex&#xE9; pour des essais parall&#xE8;les de cellules uniques, ainsi que la mesure dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN dans les agr&#xE9;gats de cellules. Nous avons &#xE9;galement d&#xE9;velopp&#xE9; 24 - et les versions 96-puits, qui sont applicables &#xE0; criblage &#xE0; haut d&#xE9;bit. Gr&#xE2;ce &#xE0; cette plateforme, nous avons quantifi&#xE9; les capacit&#xE9;s de r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN des individus de diff&#xE9;rentes origines g&#xE9;n&#xE9;tiques, et a compar&#xE9; l&#x26;#39;efficacit&#xE9; des agents chimioth&#xE9;rapeutiques anticanc&#xE9;reux potentiels que les inhibiteurs d&#x26;#39;une enzyme essentielle r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN, une endonucl&#xE9;ase AP humaine. Cette plate-forme permet d&#x26;#39;&#xE9;valuer le d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9; de multiples voies de r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN et subpathways en parall&#xE8;le, permettant ainsi &#xE0; de nouvelles strat&#xE9;gies pour la d&#xE9;couverte de m&#xE9;dicaments, de tests de g&#xE9;notoxicit&#xE9;, et de la sant&#xE9; environnementale.

Le pi&#xE9;geage seule cellule et Analyse des dommages d&#x26;#39;ADN en utilisant des tableaux de micropuits

Con un enlace directo con el c&#xE1;ncer, el envejecimiento y las enfermedades hereditarias, as&#xED; como un papel cr&#xED;tico en el tratamiento del c&#xE1;ncer, la importancia de da&#xF1;o en el DNA est&#xE1; bien establecido. El intenso inter&#xE9;s en el da&#xF1;o del ADN en aplicaciones que van desde la epidemiolog&#xED;a para el desarrollo de drogas lleva a una necesidad urgente para un rendimiento robusto, alto, y herramientas de bajo costo para el an&#xE1;lisis objetivo, cuantitativo da&#xF1;o en el ADN. Hemos desarrollado un m&#xE9;todo simple para la medici&#xF3;n de alto rendimiento da&#xF1;o en el DNA que facilitan informaci&#xF3;n sobre las lesiones m&#xFA;ltiples y las v&#xED;as. Nuestro m&#xE9;todo utiliza c&#xE9;lulas individuales capturados por la gravedad en una matriz de micropocillos con da&#xF1;o en el DNA revel&#xF3; morfol&#xF3;gicamente por electroforesis en gel. Codificaci&#xF3;n espacial permite ensayos simult&#xE1;neos de m&#xFA;ltiples condiciones experimentales se realizan en paralelo con el an&#xE1;lisis totalmente automatizado. Este m&#xE9;todo tambi&#xE9;n permite nuevas funcionalidades, incluyendo el etiquetado multiplexado para ensayos paralelos de c&#xE9;lulas individuales, as&#xED; como la medici&#xF3;n da&#xF1;o en el DNA en los agregados de c&#xE9;lulas. Tambi&#xE9;n hemos desarrollado 24 - y las versiones de 96 pozos, que son aplicables a la selecci&#xF3;n de alto rendimiento. Utilizando esta plataforma, hemos cuantificado la capacidad de reparaci&#xF3;n del ADN de los individuos con diferentes antecedentes gen&#xE9;ticos, y se compar&#xF3; la eficacia de la quimioterapia del c&#xE1;ncer como inhibidores potenciales de una reparaci&#xF3;n cr&#xED;tica enzima ADN, humanos endonucleasa AP. Esta plataforma permite la evaluaci&#xF3;n de alto rendimiento de m&#xFA;ltiples v&#xED;as de reparaci&#xF3;n del ADN y subpathways en paralelo, lo que permite nuevas estrategias para el descubrimiento de f&#xE1;rmacos, pruebas de genotoxicidad, y salud ambiental.

El reventado de los organismos unicelulares y An&#xE1;lisis de da&#xF1;os en el ADN utilizando matrices de micropocillos

Mit einem direkten Link zu Krebs, Alterung, und vererbbare Krankheiten sowie eine entscheidende Rolle in der Krebstherapie ist die Bedeutung der DNA-Sch&auml;digung etabliert. Das intensive Interesse an DNA-Sch&auml;den in Anwendungen von Epidemiologie bis hin zu Medikamentenentwicklung treibt ein dringender Bedarf f&uuml;r robust, hoher Durchsatz und kosteng&uuml;nstige Werkzeuge f&uuml;r Objektive, quantitative Analyse der DNA-Sch&auml;den. Wir haben eine einfache Methode f&uuml;r Hochdurchsatz-DNA-Schaden-Messungen entwickelt, die mehrere L&auml;sionen und Wege informiert. Unsere Methode nutzt Einzelzellen gefangen durch die Schwerkraft in eine Microwell-Array mit DNA-Sch&auml;den, die morphologisch durch Gelelektrophorese offenbart. R&auml;umliche Kodierung erm&ouml;glicht gleichzeitige Proben mehrerer experimentellen Bedingungen, die parallel zur vollautomatischen Analyse durchgef&uuml;hrt. Diese Methode erm&ouml;glicht auch neuartige Funktionen, einschlie&szlig;lich Multiplex labeling f&uuml;r parallele Einzelzelle Proben, als auch DNA-Sch&auml;den-Messung in Zelle Aggregate. Wir haben auch 24 und 96-Well-Versionen entwickelt, die f&uuml;r Hochdurchsatz-Screening gelten. Wir haben mit Hilfe dieser Plattform, DNA-Reparatur-Kapazit&auml;ten von Einzelpersonen mit unterschiedlichen genetischen Hintergr&uuml;nden zu quantifizieren und verglichen die Wirksamkeit von potenziellen Krebs Chemotherapeutika, wie eine kritische DNA-Inhibitoren Enzym, menschliche AP-Endonuklease reparieren. Diese Plattform erm&ouml;glicht hohen Durchsatz Beurteilung mehrerer DNA-Reparatur-Wege und Subpathways parallel, wodurch sich neue Strategien f&uuml;r Drogeentdeckung, Gentoxizit&auml;t und Umwelt und Gesundheit.

Einzelne Zelle &Uuml;berf&uuml;llung und DNA-Schaden-Analyse mithilfe von Microwell-Arrays.

Con un link diretto al cancro, invecchiamento e malattie ereditarie, cos&igrave; come un ruolo fondamentale nel trattamento del cancro, l&#39;importanza del danno al DNA &egrave; ben consolidata. L&#39;intenso interesse in danni del DNA in applicazioni che vanno dalla epidemiologia per lo sviluppo di farmaci spinge un urgente bisogno di robusta, alta produttivit&agrave; e strumenti economici per obiettivo, analisi quantitativa di danni del DNA. Abbiamo sviluppato un metodo semplice per le misure di danni del DNA ad alto rendimento che fornisce informazioni sulle lesioni multiple e percorsi. Il nostro metodo utilizza le singole cellule, catturate dalla forza di gravit&agrave; in una matrice microtiter con danni del DNA ha rivelato morfologicamente tramite elettroforesi del gel. Codifica spaziale consente l&#39;analisi simultanee di pi&ugrave; condizioni sperimentali eseguite in parallelo con analisi completamente automatizzata. Questo metodo consente inoltre di funzionalit&agrave; di romanzo, compreso contrassegno multiplex per dosaggi parallelo singola cella, come misura di danni del DNA in aggregati cellulari. Abbiamo anche sviluppato le versioni 24 e 96 pozzetti, che sono applicabili per lo screening high throughput. Usando questa piattaforma, abbiamo quantificato la capacit&agrave; di riparazione del DNA di individui con diversi background genetico e confrontato l&#39;efficacia di potenziali chemioterapici cancro come inibitori di un critico del DNA di riparazione enzima umano endonucleasi di AP. Questa piattaforma permette di valutazione high throughput di pi&ugrave; percorsi di riparazione del DNA e subpathways in parallelo, consentendo in tal modo nuove strategie per la scoperta della droga, test di genotossicit&agrave; e salute ambientale.

Singola cella dell&#39;abbondanza e analisi di danni del DNA utilizzando micropozzetti matrici.

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&#xB2E8;&#xC77C; &#xC140; &#xD2B8;&#xB7A9; &#xBC0F; DNA &#xC190;&#xC0C1; &#xBD84;&#xC11D; microwell &#xBC30;&#xC5F4;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

A key modality of non-surgical cancer management is DNA damaging therapy that causes DNA double-strand breaks that are preferentially toxic to rapidly dividing cancer cells. Double-strand break repair capacity is recognized as an important mechanism in drug resistance and is therefore a potential target for adjuvant chemotherapy. Additionally, spontaneous and environmentally induced DSBs are known to promote cancer, making DSB evaluation important as a tool in epidemiology, clinical evaluation and in the development of novel pharmaceuticals. Currently available assays to detect double-strand breaks are limited in throughput and specificity and offer minimal information concerning the kinetics of repair. Here, we present the CometChip, a 96-well platform that enables assessment of double-strand break levels and repair capacity of multiple cell types and conditions in parallel and integrates with standard high-throughput screening and analysis technologies. We demonstrate the ability to detect multiple genetic deficiencies in double-strand break repair and evaluate a set of clinically relevant chemical inhibitors of one of the major double-strand break repair pathways, non-homologous end-joining. While other high-throughput repair assays measure residual damage or indirect markers of damage, the CometChip detects physical double-strand breaks, providing direct measurement of damage induction and repair capacity, which may be useful in developing and implementing treatment strategies with reduced side effects.

Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.

Fluorescence microscopy is commonly used for imaging live mammalian cells. Here, we describe studies aimed at revealing the potential genotoxic effects of standard fluorescence microscopy. To assess DNA damage, a high throughput platform for single cell gel electrophoresis is used (e.g., the CometChip). Light emitted by three standard filters was studied: (a) violet light [340-380 nm], used to excite DAPI and other blue fluorophores, (b) blue light [460-500 nm] commonly used to image green fluorescent protein (GFP) and Calcein AM, and (c) green light [528-553 nm], useful for imaging red fluorophores. Results show that exposure of samples to light during imaging is indeed genotoxic even when the selected wavelengths are outside the range known to induce significant damage levels. Shorter excitation wavelengths and longer irradiation times lead to higher levels of DNA damage. We have also measured DNA damage in cells expressing enhanced GFP or stained with Calcein AM, a widely used green fluorophore. Data show that Calcein AM leads to a synergistic increase in the levels of DNA damage and that even cells that are not being directly imaged sustain significant DNA damage from exposure to indirect light. The nature of light-induced DNA damage during imaging was assessed using the Fpg glycosylase, an enzyme that enables quantification of oxidative DNA damage. Oxidative damage was evident in cells exposed to violet light. Furthermore, the Fpg glycosylase revealed the presence of oxidative DNA damage in blue-light exposed cells for which DNA damage was not detected using standard analysis conditions. Taken together, the results of these studies call attention to the potential confounding effects of DNA damage induced by standard imaging conditions, and identify wavelength, exposure time, and fluorophore as parameters that can be modulated to reduce light-induced DNA damage.

David M. Weingeist

Department of Biological Engineering

Massachusetts Institute of Technology

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

David M. Weingeist

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Massachusetts Institute of Technology

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Department of Biological Engineering