Kanser Borealis Stomatogastric Sinir Sistemi Diseksiyon

Özet

Jonah yengeç stomatogastric sinir sistemi (STNS) ( C. poyraz Elektrofizyoloji, immünhistokimya ve hücre kültürü çalışmaları için kullanılabilir). STNS çıkarma iki bölümden yapılır: kaba ve ince diseksiyon.

Özet

Iyi karakterize bir hücre nispeten az sayıda (yaklaşık 25 C borealis) içerdiğinden stomatogastric ganglion (STG), hücresel ve ağ etkileşimleri çalışmak için mükemmel bir model . STG hücreler çıkışları geniş bir sergi ve mide motor eylemler için sorumludur. Mide, üç iç dişleri ile gıda ve gıda midgut ulaşmadan önce filtreler pyloru parçalayan gastrik değirmen içerir. STG merkezi desen jeneratörleri (CPG'lerin hepsi aynı) olarak bilinen mide değirmen ve pyloru kontrol etmek için iki ritmik çıkışları üretir. STG Her hücre bu ritimleri birini veya her ikisini katılabilir. Bu CPG'lerin nöromodülasyon çalışmada, homeostazı, hücresel ve ağ değişkenlik, ağ geliştirme ve ağ kurtarma için izin verir.

Jonah yengeç (Kanser borealis) stomatogastric sinir sistemi (STNS) diseksiyonu iki parça halinde yapılır; kaba ve ince diseksiyon. Brüt diseksiyon tüm mide yengeç disseke edilir. Ince diseksiyon sırasında STNS mide bir diseksiyon mikroskobu ve mikro diseksiyon araçları (bkz. Şekil 1) kullanılarak elde edilir. STNS STG, özofagus ganglion (RG) ve commissural ganglionlar (cog) yanı sıra mide kasları innerve sinirleri içerir. Burada, ekstrasellüler kayıtları için kullanılan olurdu STG hücrelerin intraselüler ve periferik sinirleri kaydedilen olacak bir elektrofizyoloji deney için hazırlık STNS tam bir diseksiyon nasıl göstermektedir. Somata ve neuropil ortaya çıkarmak için ganglion desheathing bizim teknik olarak istenilen sinirler bulmak için uygun tekniği de gösterilmiştir.

Protokol

1. Brüt Diseksiyon

1. Hayvan donuk duyu ve motor sistemlerinin 30 dakika boyunca buz üzerinde bir yengeç yerleştirin. Buz ile her tarafta onu çevreleyen. Yengeç Kullanım sırasında eldiven giyilmelidir.
2. Diseksiyonu pan ve kullanacağınız araçları dışarı atarken brüt diseksiyon için hazırlayın. Rongeurs, kemik kesme makası, küçük makas, dişli forseps, konik kenarı ile spatula, siyah Sylgard kaplı çanak, ve böcek pimleri ihtiyaç vardır.
3. Sıkışmasını önlemek ve diseksiyon tavada yerleştirmek için, arka bacak buz kovası yengeç çıkartın.
4. Içe her bir büküm ilk pençeleri çıkarın. Sonra aynı büküm hareketi her bacak kaldırmak.
5. Rongeurs kullanarak, ağız kapsayan maksilla çıkarın. Ayrıca yumuşak maxillule çıkarın.
6. Rongeurs kullanarak tekrar karapaksla lateral posterior sonundan itibaren başlamak ve bunun kenar iyi bir kavrama olsun. Kelepçe rongeurs ile aşağı ve karapaksla bir parça kesiyorum. Spatula açılış girmesi için yeterli karapaksta kaldırmak için emin olun. Gözleri karapaksla kenarından yukarı kaldırarak, diğer tarafta devam edin ve işlemi tekrarlayın.
7. Spatula sivri tarafı hafifçe dorsal karapaksla çatı uzak yumuşak iç dokusu kazımak. Spatula STNS zarar görmesini önlemek için karapaksta ile temas halinde tutun. Rongeurs dokusundan ayrılmış karapaksla parçaları kurtulmak için kullanın. Ayrıca bazı yumuşak doku karapaksla doku ekleme adduktor kasları ayrı emin olun ventral karapaksla ayırın.
8. Karapaksta çıkıntılı iki küçük kemikçikler vardır kalbinde kadar posterior dorsal karapaksla Break Away. Gibi çok ön mümkün olduğunca kesin. Dorsal karapaksla en ön parça terkedip Cephalon ("yüz") bir parmak ile sabitleyin.
9. Karapaksla ventral tarafta, onlara ekli epistome mandibula çıkarmak için dışa büküm ve dışarı çekerek, mandibula üzerine rongeurs demir bir zamanda çene kemiklerini bir çekin. İki kasları ile uzun kemikçikler, doğru yapılırsa Ayıklanan mandibula eklenmelidir.
10. Spatula ile Gözlere yakın Cephalon iki doku ayırın. Doku tabakası tarafından, olası bir katman olarak kemik parçası sırt yakın kesen küçük diseksiyon makas.
11. Diseksiyonu pan bir duvara yengeç istirahat ve yerine o güvenliğini (pençeleri için kullanılan olabilir) desteklemek. Herhangi bir doku eklenmiş bırakmamaya dikkat ederek epistome uzak labrum (üst dudak) kesin. Kemik kesme makası kullanarak Cephalon kaldırmak için ventral karapaksla iki diyagonal kesimler yapmak.
12. Dişli forseps ile labrum ve ventral tarafta kemik parçası uzak labium ("alt dudak") kesmek. Sonra yavaşça kalan ventral karapaksla uzak dudak kaldırma. Karapaksla döşeyen doku mide ventral kısmı ayırmak için küçük makas kullanın. Mide yengeç çıkarılan kadar pilorik ampullae görünür olduğunda, bunun her iki tarafta doku uzak mide kesmek.
13. Yine de, elin avuç içi karşı mide dinlenme ve ağız içine tuzlu su dökün, forseps ile dudak mide tutarak. Bu mide genişler ve daha kolay açık kesmek için yapar. Aşağı pilorusta ampullae arasındaki kemik parçası ile sağ arasındaki ağız açılması kesin. Sonra iki Kardiyal şubeleri aracılığı ile çapraz aşağı kesti. Mide içinde üç diş ipuçları kesti.
14. Mide aşağı mide içinde büyük, siyah, Sylgard kaplı tabağa yerleştirin. Beş köşeli hazırlık böcek iğneli pin ve çanak tüm hazırlık çeker (bkz. Şekil 1), soğuk tuzlu su ile doldurun.

2. İnce Diseksiyon

1. , Mikro-disseksiyon araçları ince diseksiyon için ihtiyaç vardır. Özellikle, forseps ve yaylı makas tungsten iğne ile bir iğne tutucu yanı sıra ihtiyaç vardır. Net, Sylgard kaplı petri ve bazı ince tel pimleri da hazırlanmış olmalıdır.
2. En düşük büyütme başlayarak, ağız açıklığı için kullanılan dudak yakın kapakları aşağı iğneleyerek başlar. Hazırlık gergin yapmak ve diğer alanlarda gerekli her türlü pin pimleri geri kalanı yeniden düzenleyin.
3. Hazırlık alt kısmını kapsayan benekli hipodermis dikkatlice kaldırın ve iki beyaz nokta ile hipodermis bir yama bırakarak üzerinden bunu düzeltin.
4. Hazırlanması alt yakın sarı, bir tutam, membranöz doku kadar soyun. Mvns zayıf bu doku alt bağlıdırlar. O kadar çekilir gibi sarı doku dikkatlice mvns ayırın. Sarı doku takip ve beyin yanında kesmek.
5. Beyin çıkmadan kalın süreçlerini takip uzatmak laterally Bunlar commisural sinirler vardır. Commissural sinir sonuna ulaşıldığında, beynin yan uzak kesilmiş, off-beyaz süngerimsi doku kitle çıkarın.
6. Iyonları ve oğulları Cogs buluştuğu yer, iyonları ve oğulları uzunluğu ortaya çıkarmak için kas ve doku kesip.
7. Benekli hipodermis yama dönün ve kesti. Bu STG çevreleyen arter bir açıklık bırakmanız gerekir. , Iki kaslar bu kanadını STG ayrı delikten kesin. Bu kasların uçları yukarı kaldırın ve sağ kesim, onları arter ayırmak için alns ve agns maruz altında . Stn üzerinde uzanan kıkırdak olarak kadarıyla yan kasları ayırın.
8. Mvns, dgn STG aşağı çevreleyen arter doku kesilip, dvn karşılamak. Lvns dvn Çalışma ve lvns kaplayan beyaz, narin doku kesti.
9. Psn hazırlanması alt yakın kemik parçası üzerinde bulun. Psn LVN ve dlvn kavşak bulmak için kullanılabilir.
10. Sonraki pyn ve PDN bulmak için dlvn izleyin. Pyn sık sık açılması pilorik ampulla üzerine sarar. PDN dlvn çatal kapalı ve pilorik ampulla ve kardiyo pilorik valf kasları arasındadır. Hazırlık net Sylgard çanak transfer edildiğinde kolayca karışabilir, çünkü bu sinirlerin bağlı bazı kas bırakın.
11. Bir kez tüm sinirlerin STNS ve mide, doku ve istenmeyen sinirler arasında kalan herhangi bir bağlantıları, sever ortaya edilmiştir. Dikkatli bir şekilde, herhangi bir cevapsız bağlantıları kesme, mide geri kalanı uzakta STNS hareket.
12. Sylgard artık çok yapışkan ya da kuru hissedene kadar Sylgard yüzey üzerinde sürtünme mide dokusu kalan kitle ile açık Sylgard çanak durumu. Sylgard hidrofobik ve Sylgard kaplı çanak bu şekilde şartlandırılmış değilse STNS kuvvetle uyacaktır.
13. Çanak bazı soğuk tuzlu su ekleyin. Forseps ile commissural sinirlerin üst ucunu alın ve STNS açık Sylgard çanak getirmek.
14. STNS Sylgard üzerine sabitleyin. Commissural sinirler beyin Sever ve Minuten pimleri Cogs dört ucu aşağı ilk sabitlemek için kullanabilirsiniz. Hazırlık IVN Sylgard uzak işaret olup olmadığını kontrol sağ tarafında olduğunu emin olun. STG sağ taraftaki dgn STG altında biraz çıkmalısınız. Sinirin geri kalanı Pin aşağı ince tel iğneler ile sona erer.
15. STNS kalan kas veya doku temizleyin.
16. Desheath bir iğne tutucu ve biraz bağladım, ince, tungsten iğne kullanarak STG. STG kılıf hücre gövdeleri uzak bir köşesinde küçük bir delik açın ve bu delik kullanmak kılıf katmanları arasındaki almak için. STG neuropil ve hücre organları açığa çıkarmak için ayrılmış bir kılıf kapağı dikkatlice kesin.
17. Hücre gövdeleri erişilebilirlik artırmak ve hücre içi kayıtları için STG stabilize etmek için aşağı kılıfı herhangi bir flep Pin. Her sinir gergin ve ekstraselüler bir kayıt (bkz. Şekil 3) aralıklı sağlanması STNS geri kalanı Re-pin.

3. Sonuçlar

1. İdeal olan, tüm sinirlerin özellikle çizik ve hasar, kaydedilmiş olacak olanlar ücretsiz olmalıdır. Sinirlerin Yok karışık veya bükülmüş olmalıdır. STG neuropil etrafında bir sakal oluşumu düzenlenen tüm hücrelerin sağlam olmalıdır. Sağlam STNS bilateral simetrik ve bacaklar, kollar ve kafa olarak ön uç olarak mvns lvns bir minyatür gibi görünüyor.

Kısaltmalar:

STNS	Stomatogastric sinir sistemi
STG	Stomatogastric ganglion
COG	Commissural ganglion
RG	Özofagus ganglion
mvn	Ortalama ventriküler sinir
iyon	İnferior özofagus sinir
oğlum	Üstün özofagus sinir
AGN	Ön mide sinir
Aln	Anterior lateral sinir
dgn	Dorsal mide sinir
dvn	Dorsal ventriküler sinir
LVN	Lateral ventrikül sinir
psn	Arka mide sinir
pyn	Pilorik sinir
PDN	Pilorik dilatör sinir
dlvn	Lateral ventrikül sinirin dorsal dalı
IVN	İnferior ventriküler sinir

Şekil 1: diseksiyon önce mide STNS yaklaşık yerleştirme gösteren diyagram.

Şekil 2:, açık yeşil, mide ve STNS bir yerleşim alt kısmı çeşitli kasların Diyagramı . STG her hücre tipi kasları innerve bilinen listelenir. Bu harita, planlama, belirli bir hücre (nezaket Nadim laboratuar) bir sinyal taşıyan sinir incelemek yararlı olacaktır.

Şekil 3: STNS, hücre içi elektrotlar ve hücre dışı kuyu (Marder ve Bucher, 2007) ile şematik .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

STNS diseksiyonu bir elektrofizyoloji veya immünohistokimya deney, ya da hücre hücre kültürü elde etmek için yerine ilk adımdır. Amaçlanan deney ne olursa olsun, brüt diseksiyon değişmeden kalır. Ancak, ince diseksiyon değişebilir. Öncesinde kayıt hücreleri ve sinirler zaman planı için önemlidir. STG nöronların çoğu mide en az bir kas innerve (bkz. Şekil 2) ve innerve hedef göre sınıflandırılır süreçleri var. Bu nedenle, ekstraselüler kayıtları tam intraselüler kaydedilmiş olan bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Sylgard 170	Other	Dow Corning	170	Gross Dissection
Fine Scissors	Surgery	Fine Science Tools	14090-09
Insect Pins size 6	Surgery	Fine Science Tools	26000-65
Mayo Scissors	Surgery	Fine Science Tools	14110-17
Micro-Spatula	Surgery	WARD’s Natural Science	15 V 4313
Rongeurs	Surgery	Fine Science Tools	16000-14
Tissue Forceps	Surgery	Fine Science Tools	11021-12
Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)	Surgery	California Fine Wire Company		Fine Dissection
Forceps #5	Surgery	Fine Science Tools	91150-20
Minuten Pins	Surgery	Fine Science Tools	26002-10
Moria Spring Scissors (7mm blades)	Surgery	Fine Science Tools	15370-52
Petri Dish (100x15mm)	Other	Fisher Scientific	08-757-12
Pin Holder	Surgery	Fine Science Tools	26018-17
Super fine forceps #5SF	Surgery	Fine Science Tools	11252-00
Sylgard 182	Other	Dow Corning	182
Tungsten Needles	Surgery	Fine Science Tools	10130-05
Dissecting Microscope	Microscope	Wild	MC3	Misc.
Jonah Crab (C. borealis)	Animal	Commercial Lobster