Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

Özet

Knock-down gen ekspresyonu için bir virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) yöntemi Tanımı Nicotiana benthamiana Ve domates.

Özet

RNA enterferans (RNAi) dsRNA ¹ tarafından tetiklenen son derece özel bir gen susturulması olgudur . MicroRNA, non-protein kodlayan genlerin ve kısa müdahale RNA'lar (siRNA) üretilmektedir: Bu susturma mekanizması RNA düzenleyiciler iki ana sınıfları kullanır. Tesisleri transpozonlar kontrol etmek ve çiçek organ oluşumu ve yaprak gelişimi ^2,3,4 gibi gelişim süreçleri üzerinde sıkı bir denetim uygulamak için RNAi. Bitkiler de virüsler tarafından enfeksiyona karşı kendilerini savunmak için RNAi kullanabilirsiniz. Sonuç olarak, birçok virüs, ev ^sahibi 5 başarılı kolonizasyon izin susturma gen bastırıcılarının evrildi .

Virüs indüklenen gen susturulması (VIGS) bitki RNAi aracılı antiviral savunma mekanizması yararlanan bir yöntemdir. Değiştirilmemiş virüsleri ile enfekte olmuş bitkilerde mekanizması, özellikle viral genom karşı hedeflenmektedir. Ancak, ana genlerden kaynaklanan dizileri taşıyan virüs vektörleri, süreci ek karşılık gelen ana mRNA'ların karşı hedef olabilir. Plazmid Ti, tamamını ya da susturulması için hedeflenen gen dizisinin parçası taşıyan rekombinant virüs yoluyla VIGS teslim bitki patojen Agrobacterium tumefaciens kullanılarak bitkilerde yüksek verim fonksiyonel genomik için adapte edilmiştir. Sistemik virüs yaymak ve endojen bitki RNAi makine geri kalanının özen gösterin. hedef gen ilgili dsRNAs uzunluğu 21 ila 24 nükleotidler siRNA'lar içine Ribonükleaz Dicer tarafından üretilen ve sonra parçalanır. Bu siRNA'lar sonuçta hedef transkript ² düşmeye RNA-indüklenmiş susturma kompleksi (RISC), rehberlik eder.

Farklı vektörleri VIGS istihdam edilmiş ve en sık kullanılan bir tütün çıngırak virüsü (TRV) dayanmaktadır. TRV, iki taraflı bir virüs olup, iki farklı A. tumefaciens suşları VIGS için kullanılır. Bir kat protein ve VIGS ^6,7 için kullanılan sırasını, pTRV2, diğer limanlarda ise çoğaltma ve hareket viral fonksiyonları kodlar pTRV1 taşır. Aşılama Nicotiana benthamiana ve gen susturulması suşları sonuçları hem bir karışımı ile domates fideleri. Photobleaching neden endojen phytoene desaturaz (PDS) gen, susturma VIGS verimliliği için bir kontrol olarak kullanılır. Ancak, belirtmek gerekir ki, bu susturma domates genellikle N. daha az verimli benthamiana. Ilgi genin RNA transkript bolluğu her zaman hedef gen verimli down-regüle edildiğini sağlamak için ölçülmelidir. N. Bununla birlikte, heterolog gen dizileri benthamiana domates ve tam tersi ⁸ kendi orthologs susturmak için kullanılabilir.

Protokol

Bölüm 1: Bitki materyali

N. benthamiana susturmak için kullanılan bitkiler yaklaşık 2 ½ olmalıdır hafta eski kotiledonlarında ve ilk 2 - 4 gerçek yaprakları ortaya çıkmıştır. 8 gün sonra ortaya çıkması, gerçek yaprakları henüz görünürde yoktur - Domates (Solanum lycopersicum) bitkiler 7 kullanılır .

Bölüm 2: VIGS

1. GÜN

1. Her deney için, 50 mg / ml kanamisin ve 100 mikrogram / ​​mL rifampisin ile desteklenmiş LB agar plaklarına pTRV1 barındıran Agrobacterium tumefaciens, pTRV2, pTRV2-PDS ve pTRV2-host hedef geni yetiştirilmektedir. Rifampisin Agrobacterium için kanamisin pTRV plazmid için seçer. Plaka, 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   PDS susturma photobleach bitkiler neden olur ve susturulması etkinliğini kontrol olarak kullanılır. Ayrıca, bir pTRV2 vektör içine downregüle olması genleri klonlanmış olmalıdır. Klonlama kolaylaştıracak bir Gateway uyumlu pTRV2 vektör ve Liu ve ark tarafından açıklanmıştır. (2002).

3. GÜN

1. Suşlarının her biri için yukarıda belirtilen antibiyotikler ile 3 ml LB sıvı kültür - 2 İnokülasyon. 16 - 18 saat ve 200 rpm, 30 ° C'de sallayarak inkübe

4. GÜN

1. Kanamisin, rifampisin ve 200 mcM acetosyringone (Tablo 1, 2 ve 3) ile ikincil bir sıvı İndüksiyon Medya (IM) Sohbet kültür birincil kültürü 25 seyreltme: 1 inoküle edin. Acetosyringone bir sohbet ortamı ev sahibi apoplast bu patojen karşılaştığında taklit ederken bitki ⁹ T-DNA transferi için gerekli olan Agrobacterium vir genlerin indükleyicisi olarak kullanılır. 30 ° C'de 20 sallayarak inkübe - 24 saat ve 200 rpm

5. GÜN

1. 3000 x g. az 10 dakika süreyle centrifugating hücrelerin Hasat Orijinal kültür, 10 mM _MgCl 2, 10 mM (MES), pH 5.5 ile aynı hacim içinde süspanse edin . Hücreler nazikçe onları tekrar süspansiyon vortekslenmiş olabilir.
2. 3000 x g. az 10 dakika için tekrar hücreleri Centrifugue Orijinal kültür yarım hacmi 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH = 5.5 ile tekrar
3. Her bir bakteri kültürü için bir OD _0.3 600 bakteriyel bir süspansiyon hazırlayın . PTRV1 kültürüne 400 mcM nihai konsantrasyonu acetosyringone ekleyin.
4. PTRV1 ve 1'e 1 oranında (ya da ilgi gen içeren pTRV2) pTRV2 içeren kültürlerin karıştırın. Ayrıca bir pTRV2-PDS kontrol içerir. Nihai acetosyringone konsantrasyonu 200 mcM ve her kültürün 0,15 OD ₆₀₀ olduğunu lütfen unutmayınız.
5. Etiket susturuldu gen ve deney tarihi ile infiltre fide.
6. Her yaprak bir iğne ile infiltre içine bir delik Poke. Bakteriyel süspansiyon fide içine sızmak için 1 ml gereksiz şırınga kullanın. N. ise domates, iki kotiledonlarında sızmak benthamiana, en büyük iki gerçek yaprak sızmak. Beş mL her bir bakteri karışımı 15 N. sızmak için yeterli olacaktır benthamiana ve 25 domates fideleri. Ve aşılama sonraki güne kadar bitkilerin sulanması infiltrasyonlar arasında değişen eldivenler tarafından çapraz kontaminasyon kaçının.
7. Bitkiler 20 tutulur - 22 ° C 16 saatlik gün uzunluğu ve deneyleri için kullanılan olabilir önce en az 3 ½ hafta RH% 50 bir büyüme odasında.

Bölüm 3: Temsilci sonuçları

Şekil 1, N. ile temsil eden bir deney gösterir benthamiana ve domates bitkileri PDS susturuldu. Bitkiler azalmış miktarda karotenoid bitkilerde görülen karakteristik photobleaching fenotip göstermektedir. PDS sessiz kontrol bitkiler için photobleaching başlar, kısa sürede 1 olarak görülebilir ½ hafta infiltrasyon sonra.

Şekil 1 PDS kontrol gen susturma N. benthamiana (A) ve domates (B) bitkiler photobleaching neden olur. Fotoğraflar susturulması 3 ½ hafta sonra alındı.

Tablo 1: İndüksiyon Orta (IM) hazırlanması.

400 mL	distile H 2 O
4.88 g	MES (2 - (4 morfolino)-etan, propan sülfonik asit)
2.5 g	Glikoz
0.12 g	NaH 2 PO 4

DH ₂ O son hacim 475 mL getirin ve 5.6 pH ayarlamak. Otoklav. Orta soğuduktan sonra, 25 ml 20X AB tuzları ekleyin.

Tablo 2. AB tuzları hazırlanması.

20 g	NH 4 Cl
6 g	MgSO 4 · 7H 2 O
3 g	KCl
0.2 g	CaCl 2
0.05 g	FeSO 4 · 7H 2 O

1 litre saf su ile son hacim kazandırın. Otoklav. AB tuzları turuncu bir toz olarak hızlandırabilir farkında olun. Sadece kendi kullanmadan önce dönen iyice karıştırın.

Tablo 3. 200 mM Acetosyringone hazırlanması. Acetosyringone kullanılacak günlük hazırlanması gerektiğini lütfen unutmayınız.

19.6 mg	Acetosyringone (3 ', 5'-dimetoksi-4'-hydroxyacetophenone)
500 mcL	DMSO (Dimetil sülfoksit)

Tartışmalar

Virüs indüklenen gen susturma, hızlı bir şekilde ters genetik ekranlar veren bir yöntem. T-DNA veya Arabidopsis ve mısır gibi bazı bitkiler mevcuttur transpozon aracılı gen knock-çıkışları, üretimi önler. Ayrıca bitki dönüşüm zaman alıcı bir süreç circumvents ve yeterli homoloji ¹⁰ ya da susturulması vektör ^{6, 11} farklı ana hedef dizileri tandem düzenlenmiş olması kaydıyla, aynı anda birden fazla genin hedef sağlar.

Ancak, su...