Desenlendirme Biyomoleküller Mikroelektronlar Kendinden monte mono tabakaları Zehirli

Özet

Biz altın Mikroelektronlar bir silikon taban üzerinde bir poli (etilen glikol), kendinden montajlı tek tabaka (PEG-SAM) oluşturmak için bir prosedür mevcut. PEG-SAM, tek bir adımda oluşan ve silikon ve altın yüzeyler biofouling engeller. Elektroforez sonra nano ölçekli desenlendirme biyomoleküllerin için kullanılır.

Özet

Biz, altın Mikroelektronlar, bir silikon taban poli (etilen glikol) (PEG) trimethoxysilane kendinden montajlı tek tabaka (SAM) oluşturmak için bir prosedür mevcut. PEG-SAM tek bir montaj adımda oluşturulur ve silikon ve altın yüzeyler üzerinde biyolojik kirlenmeye engeller. SAM standart, pozitif ton litografi desenli ceket Mikroelektronlar kullanılır. Mikrotübül bir örnek olarak kullanarak, geri dönüşümlü bir şekilde SAM-örtülü elektrot elektroforetik göç ikna etmek için bir DC gerilim uygulanır. Bir akış odası, görüntüleme için elektroforetik göç ve mikrotübül desenlendirme kullanılan

Protokol

Reaktiflerin hazırlanması

BORU tamponu (pH 6,8 KOH ile ayarlanmış 80 mM BORU 1mm MgCl _2, 1mm EGTA) hazırlayın. -70 Ve mağaza kısım glukoz oksidaz, katalaz ve glikoz ° C ve taksol -20 ° C mevcut protokollere göre ^1,2 Temsili miktar ve mağaza tubulin -70 ° C tedarikçi tarafından verilen talimatlara göre.

Litografi kullanarak Desen Au Mikroelektronlar

1. Bir katip veya gofret kesici kullanarak 1 cm 1.5 cm substratlar içine silikon gofret kesin. Kapak ve 5 dakika sonikasyon kadar aseton beher yerleştirerek substratlar temizleyin. Yüzeylerde kurumasına izin vermeden, taze aseton onları yıkayın, sonra hemen izopropanol ve kuru nitrojen içinde durulayın.
2. Au Mikroelektronlar temiz yüzeyler üzerinde istenen özellikleri boyutuna bağlı olarak, standart, pozitif tonu fotolitografi veya elektron demeti litografi kullanarak imal ³ desen geometri tasarlarken, kapsama sağlamak için her elektrot desen çapı 100 mikron altında tutmak PEG SAM (sonraki bölümde açıklandığı gibi). Yastık bağlayan bir elektrot (Şekil 1) ile 1 mm çizgi ile desen, 500 mm ile 300 konumlandırılmış temas pedleri (~ 300 ^mm 2) ekleyin . Akışını odasının montajı için desen etrafında yer kalmasına izin verecek yüzey ortasına yakın litografik kalıpları yerleştirin.
   
   Şekil 1. Örnek geometri. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
3. Karşı katmanı desen kalkınma sonra, karşı temas pedi cımbız kullanarak (Şekil 1) substrat kenarına bir çizgi çizebilir. Metal birikimi üzerine, sıfırdan elektrot ve yüzey kenarı arasındaki elektriksel temas sağlayacaktır. Biriktirme haznesi, tercihen iki kaynaktan ile bir metal katmanı yatırmak için kullanılır. Elektrotlar vakum bozmadan, Au 6 nm takip Cr 2 nm birikimi (yapışma) tarafından oluşturulur. Odasının içine donatılmış bir kuvars kristali mikro depolanması sırasında filmlerin kalınlığı ölçmek için kullanılabilir.

SAM hazırlayın

1. Onceden ve iyi havalandırılan bir alanda fırın - 75 ° C 250 ml cam beher 20 mL toluen ekleyerek silanization çözüm hazırlayın. Daha sonra plastik bir pipet kullanarak toluen için 1 ml PEG-silan (yani% 5 v / v) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme 5 ila 10 kat ve daha sonra 30 saniye boyunca pipet ile karıştırarak PEG-silan iyi karıştırın.
2. PEG-silan toluen çözümü tamamen sular altında ve eşit olarak beher alt kısmında aralıklı emin olun desenli örneklerin beher desenli yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Fırında behere koyun ve 18 ila 21 saat fırında 75 ° C. SAM oluşturan iken, counterelectrode hazırlamak (aşağıya bakınız) ve kalan adımlar için gerekli olan tüm ek parçaları bir araya toplamak.
3. Fırında 18-21 saat sonra, toluen, PEG-silan viskoz bir kalıntı desenli örnekler bırakarak buharlaşır gerekir. 20 mL toluen beher ekleyin ve 1-2 dakika örnekleri bekletin. Örnekleri kaptan çıkarın ve sonra toluen, izopropanol durulayın ve nitrojen ile nihayet kuru. Bu noktada, numuneler temiz bir görünüm ve SAM katmanı çıplak gözle görünmez olmalıdır. SAMs serin kuru hava şartlarında (25 ° C, orta nem) altında saklanan iki gün kadar kullanılabilen bu şekilde hazırladı. Yüzeyinde bulutlu veya düzensiz Mutfak dekorasyonunun puf noktalari kalıntı kaplama Başarısız SAM oluşumuna neden olur.

Counterelectrode Üretiyor

Mikroelektrot depolanması için kullanılan aynı birikimi odasının kurulumu, 22 x 50 mm No 1 ya da 0 no'lu cam lamel üzerine Au 4 nm Cr 1 nm, para yatırma bir counterelectrode olun. Counterelectrode açık gri ya da pembe bir renk tonu ile neredeyse şeffaf olmalıdır. Temiz tutmak için bir Petri kabındaki kaplı yan counterelectrode saklayın.

MTS içine polimerize tubulin

1. Çözülme tubulin ve rodamin tubulin etiketlenmemiş ve hemen elde etmek için parlak MTS etiketsiz için etiketli 1:2 oranında kombine. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme karıştırın. Isıtılmış su banyosunda 20-40 dakika tubulin polimerize 37 ° C. MTS uzunluğu uzun polimerizasyon kez daha büyük olacaktır. Tubulin polimerize olmasına rağmen, 20 mM için taksol BORU tampon içeren bir mikrosantrifüj tüpe ekleyerek BORU taksol tampon hazırlamak. Yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez ve vorteks taksol iyi karıştırın ve daha sonra 37 ısıtılmış banyoya tüp yeri ° C. Polimerizasyon sonra, sıcak BORU taksol tampon ve kalkan 1 / 100 MTS sulandırmakışıktan. Bu şekilde hazırlanan MTS zaman ve paket, daha fazla seyreltme azaltılabilir uzayacaktır.
2. 30 ml soğuk BORU tampon (0-4 ° C), 2-mercaptoethanol% 50, 5 ml katalaz glukoz oksidaz, 5 ml ve 5 ml glikoz 5 ml birleştirerek 10x oksijen süpürücü karışımı (OS) hazırlayın. ² Glikoz son ilave edilmelidir. Her bileşen ekledikten sonra 3-5 kez pipetleme ve aşağı çevirerek karıştırın. OS karışımı buz koyun, yaklaşık 2 saat boyunca etkili olmaya devam edecektir.
3. MT polimerizasyon başarılı oldu ve MTS görüntüleme 1x OS karışımı ile hazırlanan MTS floresans uyarma birkaç dakika altında stabil olduğunu doğrulayın. Görüntüleme için bu şekilde hazırlanan MTS, rodamin floresan için uygun bir uyarma / emisyon filtre kombinasyonu kullandığınızdan emin olun. BORU 1x OS karışımı ile tampon ve görüntüleme kullanarak 1 / 10 ila 1 / 100 MTS seyreltilmesi görüntüleme bireysel filamentler için en iyi çalışma seyreltme belirleyin.
4. Bir akış odası, iki adet çift taraflı bant dışında 2-3 mm yerleştirilir büyük (22 x 50 mm) ve küçük (22 x 22 mm) cam lamel sandviç hazırlayın. Bant cam slayt üzerine yerleştirerek ve bir jilet kesim tarafından kolayca şeritler halinde kesilir. Mikropipet kullanarak akış hücre içine MTS bir kaç mikrolitre tanıtın. Yüksek büyütme görüntüleme için, uzun çalışma mesafesi hedefleri üst yüzey akış odasının görüntüleme için gerekli olabilir. Lamel / numune yüzey akış odasının üst yüzeyi arasındaki mesafe bant kalınlığına göre belirlenir ve 60-100 mm olmalıdır.

Desen MTS elektroforez kullanarak

1. Elektrot bant (Şekil 2) dik çalışan bağlantı yolu ile şeritler arasında olduğu gibi, desenli, SAM-kaplı numune üzerinde çift taraflı bant iki ince şeritler koyarak bir elektroforez odasının hazırlayın. Yaklaşık 3 mm (Şekil 2) tarafından örnek çıkıntılar counterelectrode kenarında çift taraflı bant, teyp gibi dokunmadan metal yüzü counterelectrode yerleştirin. Birkaç 15 cm uzunlukta, yalıtılmış bakır mıknatıs tel kesin ve her iki ucunda 1 cm yalıtım kapalı şerit. Counterelectrode (bu bir multimetre ile kontrol edilebilir) ile elektrik kontağı yapmaktan kaçınmaya dikkat çekerken, küçük bir damla gümüş boya kullanarak substrat maruz Au alan bir tel takın. Counterelectrode gümüş boya kullanarak ikinci bir tel takın. Teller gümüş boya ile bağlı bant ile örnekler daha güvenli olabilir.
   
   Şekil 2 ters bir floresan mikroskop Flow hücre montajı. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .
2. 1x final konsantrasyon OS ile birlikte BORU tampon kullanarak istenilen seyreltme MTS tanıtın. 20X büyütme Görüntü ve bir voltaj uygulamadan önce silikon gofret desen bulmak. İsteğe bağlı olarak, akış odasının, akışkan akışı ve akış odasının düzlemde MT göçü önlemek için oje kullanılarak kapatılmalıdır.
3. 1 V kadar bir gerilim uygulayın ve MTS göç gözlemlemek. MTS, geri dönüşümlü hapsi istenen ise daha düşük voltaj (yaklaşık 0.5 V) kullanılıyor olabilir, ancak bu yanal kayma önlemek için akış odasının sızdırmazlık gerektirir. Tırnak cilası akış odasının açık biter sızdırmazlık için iyi çalışır. V 0.7 hakkında yukarıda gerilimler, bazı MT yapışma zayıf olsa, desen olabilir. Yaklaşık 0,9 V Yukarıdaki gerilimler, MT göçü daha hızlı olacak ve yapışma güçlü olacak. Mikroelektronlar yok etmek için de indükleyici elektroliz (gaz kabarcığı oluşumu) ve yaklaşık 1,2 V üstünde olasılığını önemli ölçüde artırır. Göç mikroskop odak dikey düzlemde ayarlayarak takip edilebilir. Doğru şekilde yapılmazsa, MTS elektrot yüzeylerinde lokalize.

Tartışmalar

MTS, göç nedeniyle parlaklık ve düşük eşiğe kolayca floresan mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Sadece biyomoleküllerin tampon pH uygun ayarı ile net ücret taşımak için ikna olmasını gerektirir Bu yöntem, genellikle biyomolekülün desenlendirme için geçerli. Kapiler elektroforez kullanılan silika duvarlar gibi hiçbir ücret yüzeyleri vardır çünkü Electroosmosis Bu kurulum kaçınılmalıdır.

Bu yöntem çeşitli değişiklikler yapılabilir. Sızdırma...

Malzemeler