Omurilik Elektrofizyoloji

Özet

Elektrofizyolojik çalışmalar için yenidoğan fare omurilik izolasyonu bir gösteri.

Özet

Yenidoğan fare omurilik sinir circuitries ve lokomotor hareketin gelişimi eğitimi için bir modeldir. Biz spinal kord diseksiyon ve lokomotor çalışmaları için kullanılan kayıt banyo yapay beyin omurilik sıvısı hazırlanması göstermektedir. Disseke, omurilik ventral sinir kökleri lomber kord içinde merkezi desen üreten devre elektrofizyolojik sinyaller kaydetmek için bir kayıt elektrot bağlı olabilir.

Protokol

1. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) 1 hazırlayın. Biz ilk magnezyum veya kalsiyum olmadan aCSF 10X stok 2L hazırlamak. Reaktifler millimolar listelenir. Katalog numaraları Sigma / Aldrich bakın.

2 Litre 10X aCSF (Mg veya Ca olmadan)
Reaktif	mM	g/2L	Katalog
KCl	40	5,96	P-9333
NaCl	1280	149,61	S-7653
NaHCO 3	210	35,28	S-6297
NaH 2 PO 4	5	1,38	S-9638
Glikoz	300	108,12	D-9434
2L distile su ekleyin

Ayrıca, deney deney yapmak molarite ayarlamalar için izin 50ml su _{MgSO 4} ve _CaCl 2 1M çözümler hazırlamak ve kalsiyum çözelti içinde kalmasını sağlamak için .

1M Kalsiyum ve Magnezyum Stoklar
Reaktif	M	g/50mL	Katalog
CaCl 2	1	7,35	C-5080
MgSO 4	1	12,33	M-5921

ACSF çözüm çökelek kalsiyum veya kalsiyum eklemeden önce pH düşük carbogen (% 95 O2 /% 5 CO2) ile gaz verilerek olmalıdır.

1 Litre aCSF
Reaktif	Hacim
10X aCSF	100 mL
1M CaCl 2	1 ml (diseksiyon) 2mL (kayıt)
1M MgSO 4	1 ml
Kalsiyum eklemeden önce ~ 800 mL distile su, 2 dakika süreyle carbogen gaz ekle
1L distile su ekleyin.

Pompaları ve tüp ve diseksiyon yemekleri kullanımdan önce ve sonra durulanmalıdır.

Diseksiyon

Diseksiyon iken, 1mm kalsiyum aCSF sürekli carbogen ile gaz verilerek olmalıdır. ACSF bir şişe diseksiyon çanak hortumlandığını ve şişe diseksiyon çanak pompalanır veya atık gönderilen olabilir. Biz bir elastomer (Sylgard Dow Corning) diseksiyon kaplı çanak kullanın.

Yenidoğan fare hızla, keskin bir makas ve makas ile ventral göğüs kafesi ve karın yoluyla yapılan bir kesi ile dekapite. Hayvan sonra boşaltılmış. Parçalanmış fare aCSF ile durulanır. Hayvan daha sonra, ön ayakları ile kuyruk dibinde eklenen böcek iğneli diseksiyon çanak tutturulmuş.

Omurga ventral laminektomi gerçekleştirerek kaldırılır. Omurga küçük forseps ile düzenlenen ve küçük bir makas, bir bıçak, kemikli omuriliğe hemen sırt eklenir. Lamina kemik spinal sütun hafifçe kaldırırken bir tarafında ve diğer kesilir. Bu omurganın uzunluğu için yapılmaktadır.

Omurilik, spinal sinir köklerini koparmaya ve omuriliği saran meninksler kesmek için, omuriliğin her iki tarafında boyunca kesim tarafından kaldırılır. Biz, sağ ve sol tarafta kesim, daha sonra serbest omuriliğin dorsal tarafına bağlı meninksler kesti. Izole kablosu, daha sonra iyi oksijenasyon sağlamak için ek hayvanlar disseke aCSF giriş yakınındaki çanak tutturulmuş.

Izole spinal kord sonra küçük bir kaşık veya spatula kullanarak kayıt çanak aktarılır. Burada oksijenli 2mm kalsiyum aCSF hazırlık serpmek. Omurilik elastomer kaplı çanak ve köklere yakın ekstrasellüler, bütün kök emme elektrotlar taşımak için kullanılan mikromanipülatörler tutturulmuş. Elektrot ucu serbest kök sonuna yakın, nazik emiş emme elektrot içine kök çekmek için uygulanır. Bu süreç, aynı anda birden fazla kökleri kaydetmek için tekrar edilebilir.

Şekil 1. Decapitation ve eviserasyon A. Hızla keskin bir makas ile fare başını kesmek. Beyin sapı az ya da çok katkıları kesme düzeyine bağlı olarak elde edilebilir. Dekapitasyon tarafından oluşturulan göğüs boşluğunun açılması makas B. Place bir bıçak. Ventral toraks ve karın, kuyruk tabanına açın. Organlar çıkarın ve aCSF ile durulayın.

Şekil 2. Omurilik A. kaldırılması Makas, spinal kord ve kord ventral döşeme kemikler yoluyla kesilen sağ spinal kolon ve spinal kord arasındaki boşluğa sol bıçak yerleştirin. Sonra, belkemiği ve omurilik, omurilik ve kesme sol arasındaki boşluğa makas sağ bıçak yerleştirin. B. omuriliğe nazik çekiş uygularken bu işlemi tekrarlayın. Makas düşük bir açıyla tutarak ponksiyon spinal kord dikkat edin.

Şekil 3. Omurilik kaldırılması A.. Makas omurilik ve kablosunu yan döşeme spinal kökleri ve meninks ile omurilik ve kesme hakkı kemikleri arasındaki boşluğa sol bıçak yerleştirin. Sonra, omurilik ve kemikleri arasındaki boşluk içine makas omurilik sol sağ bıçağının ve kablosunu yanal döşeme spinal kökleri ve meninks kesti. B. Ve son olarak rostral kord yavaşça kaldırın ve lamina dorsal kablonun meninksler kesmek. Yine, düşük bir açıyla makas tutarak ponksiyon spinal kord umurumda değil. Omuriliğe çok yakın kökleri kesmeyin.

Tartışmalar

Izole yenidoğan omurilik, sinir sistemi development1, 2 eğitim uysal bir yöntem sağlar. Neonatal kemirgenler lomber spinal kord içinde, merkezi desen üreten devre nörotransmitterlerin varlığı kurgusal lokomosyon üretebilir. Bu kurgusal lokomosyon 0,2 - 0,5 Hz üretilmektedir ritmik artar, aktivite patlamaları, oluşur. Bu patlamaları kablosu ve fleksör-ekstansör münavebe (L5 ipsilateral L2 akrabası) uzunluğu boyunca sol-sağ arda üretmek için organize edilir. Anormal davranış 3-5 farelerde bazı ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl		P-9333
NaCl		S-7653
NaHCO3		S-6297
NaH2PO4		S-9638
Glucose		D-9434
CaCl2		C-5080
MgSO4		M-5921
Large Scissors	Fine Science Tools	14070-12
Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask