Ölçüm% 50 Hemolitik Kompleman (CH 50</subSerum) Faaliyet

Özet

Klasik yolu antikor tarafından aktif ve hedef hücre parçalama içinde sona eriyor. CH ₅₀ Testi serum örneğinde kompleman aktivitesi bir ölçüsüdür sağlar. Bu video CH belirlenmesinde yer alan adımları gösteriyor ₅₀ Serum numune sonuçları hesaplama ve yorumlama.

Özet

Kompleman sistemi, hücre parçalama hedef yol opsonisation yoluyla aktif ve fagositoz kolaylaştırır proteinlerin bir grup. Bireysel kompleman, ancak bu yolun aktivite olarak herhangi bir bilgi sağlamaz belirlenebilir. CH

Protokol

5x veronal Tamponlu Salin (VBS) hazırlanması

1. Veronal Tamponlu Salin (VBS) hazırlamak için, üç ayrı çözüm hazırlıklı olması gerekiyor.
2. Distile su 350ml Sodyum barbital NaCl ve 0.94gm 21.25gm çözme çözüm 1 hazırlayın. NaCl ve sodyum barbital son konsantrasyonları sırasıyla 1.02m ve 13mm.
3. Barbital, 125ml sıcak distile su 1.44gm eriterek çözüm 2 hazırlayın. Barbital son konsantrasyon 62.5mm.
4. Distile su 100 ml CaCl ₂ MgCl ₂ ve 4.41gm 20.33gm eriterek çözüm 3 hazırlayın. MgCl ₂ ve CaCl ₂ final konsantrasyon sırasıyla 2,18 m ve 440mm.
5. Mix çözüm 1 ve 2 ve oda sıcaklığına kadar soğumasını.
6. Kombine çözüm soğuduktan sonra, çözüm 3 1.25ml eklemek ve pH 7,3-7,5 1M HCl kullanarak ayarlayabilirsiniz.
7. 5x bir stok solüsyonu hazırlamak için 500ml için son hacim distile su ile ayarlayın.
8. 1x çalışma çözeltisi hazırlamak için, saf su ile seyreltilmiş hisse 01:05.

Haemolysin koyun kırmızı kan hücreleri, Duyarlayıcılık

1. Öncelikle VBS ile 01:50 sulandırmaya haemolysin hazırlayın
2. SRBC için 4ml VBS 6ml ekleyin ve yavaşça tersine çevirerek karıştırın
3. 600g x 5minutes santrifüjleyin
4. Süpernatantı atın ve hücrelerin başka bir 2 kez yıkayın
5. Son yıkamadan sonra, hücreleri paketi 900g x 5minutes hücreler santrifüj
6. Paketlenmiş hücrelerinin% 10 çözüm yani 0.5 ml hazırlamak için yeterli VBS hücrelerin tekrar süspansiyon supernatant atın ve 5 ml tampon yeniden süspanse
7. Sürekli dönen hücrelere haemolysin eşit hacmi (tavşan anti-koyun kırmızı kan hücresi antikor) eklemek Damlatarak
8. Bir su banyosunda 30 dakika süreyle 30 ° C'de inkübe
9. Yavaşça hücreler her 15 dakika bir arada
10. Hassas SRBC 4 geceleme saklanabilir ° C

CH ₅₀ tahlil

1. 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 ve 1:128 ile yinelenen tüpler bir dizi etiketleyin.
2. Nüsha halinde, her VBS kontrol ve test serum iki kat seri dilüsyonları bir dizi hazırlayın
3. 01:04 'da başlayacak (100ml serum + 300ml VBS) ve sonraki etiketli tüpe örnek 200ml aktarmak.
4. Taze bir pipet ucu ile sonraki seyreltme dilüsyonları ve transfer 200ml arasında iyice karıştırınız.
5. Beş dilüsyonları yapılıncaya kadar bu işlemi tekrarlayın.
6. Son 1:128 dilüsyon 200ml atın.
7. Tüm tüpler askıya sensitize SRBC 200ml ekleyin.
8. Etiket iki ayrı tüpler gibi BLANK ve hassaslaşmış SRBC + 200ml VBS 200ml eklemek. Bu tüpler VBS SRBC spontan lizis ölçecek.
9. TOPLAM lizis olarak başka iki ayrı tüpler Etiket ve sensitize SRBC + 200ml distile su 200ml eklemek.
10. Tüm tüpler hafifçe karıştırın.
11. 37 ° C'de 15 dakika sonra karıştırılarak su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
12. Tortu eritrositlerde 5 dakika boyunca 1.500 g örnekleri santrifüjleyin.
13. 96 sıra düz dipli plaka her tüp süpernatant 100ml iyi transfer.
14. Her bir kuyunun 100 ml distile su ekleyin.
15. 540nm bir tabak spektrofotometre kullanılarak örneklerin absorbans okuyun.

Hesaplamalar

1. Her bir örnek için ortalama absorbans hesaplayın
2. Tüm örneklerde BLANK absorbans (kendiliğinden lizis) çıkarma
3. Aşağıdaki formül kullanılarak her dilüsyon için% lizis hesaplayın:
   
4. Yatay eksende serum seyreltme karşı yüzde lizis (dikey eksen) çizilir.
5. Kontrol ve test serum (Şekil 2) için% 50 hemoliz için gerekli seyreltme hesaplayın.

Temsilcisi Sonuçlar:

Video temsilcisi sonuçlar bir örnek içerir. Uygulamada, bir kontrol serumu da test serum olarak aynı anda çalıştırmak ve aynı şekilde tedavi edilir. Aşağıda (Tablo 1), test edilmiş bir serum örneği örnek veri. 5.3 'te sunulan denkleme göre veri değiştirilebilir.

Örnek	OD 540	Ortalama
Boş	0.042, 0.044	0,043
Toplam lizis	0.183, 0.183	0,183
Seyreltme	OD 540	Ortalama	Boş Ortalama-	% Lizis
01:08	0.200, 0.219	0,210	0,168	116
01:16	0.179, 0,173	0,176	0,134	93
01:32	0.134, 0.110	0,122	0,08	55
1:64	0,053, 0,066	0,059	0,017	12
1:128	0.044, 0.045	0,045	0,003	2

Şekil 1. Klasik kompleman yolunun aktivasyonu klasik bir yolu, bir hedef hücre yüzeyinde bağlayıcı immünglobulin M (IgM) veya immünglobulin-G (IgG) tarafından aktive edilir. Ab Fc kısmı C1q bağlar C1r aktif ve bu da birlikte iki molekül C1S aktive C1r başka bir molekülü harekete geçirir. C1S şimdi de bölünmüş C2 için bağlayıcı bir site ortaya C4 parçalayarak. C4b ve C2A bağlayıcı C3 konvertaz olarak adlandırılan bir kompleks oluşumuna yol açar. Bu karmaşık bir C5 konvertaz oluşturan C3 konvertaz ile birleşerek bazıları C3 şekillendirme C3a ve C3b keser. Bu kompleks, C6 membran atak kompleksi (MAC) oluşumunu başlatmak bağlayıcı çıkan C5b, C5 davranır. C5b6 eylemleri, C7, C8 açmak hareket ve sonuçta C9 son MAC oluşumu ile sonuçlanan. (Goldsby ve ark, 2003).

Şekil 2. Örnek verileri çizilmesi ve bir kontrol ve test serum örneği için CH50 hesaplanırken (A), (•) kontrol ve test () serum örnekleri hem de hesaplanan yüzde (%) lizis dilüsyon faktörüyle karşı çizilmiştir. Grafik hatları ile kesişiyor ve sonra seyreltme aşağı dikey bir çizgi çizilir kadar (B)% 50 lizis hesaplamak için,% 50 oranında değer bir çizgi çizilir. Bu örnekte, kontrol ve 21,6 kat seyreltme test serum 35 kat seyreltme% 50 lizis ulaşmak için gereklidir. Bu veriler test serum,% 50 lizis ulaşmıştır önce daha az sulandırma gerektiği gibi kontrol ile karşılaştırıldığında daha az tamamlayıcı olduğunu gösterir. Kontrol örneği de 01:08 seyreltme>% 100 lizis gösterir. Bu tamamlayıcı bileşenleri tarafından Damıtılmış su ve daha verimli lizis SRBC eksik lizis nedeniyle büyük olasılıkla.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

CH ₅₀ testinin pek çok etkileşimler tabi. Bazı SRBC tamamlayan ilişkisiz spontan hemoliz, diğerlerine göre daha kırılgan. Tavşan antikoru yakınlığı çok çok ve bir üreticiden diğerine değişir; bu SRBC bağlar antikor miktarını etkiler. Ayrıca, farklı miktarlarda antikor kaplama SRBC hücrelerinde antikor sonuçları ile SRBC duyarlılaştırıcı süreci. Örnek toplama ve depolama hatası önemli bir potansiyel kaynak vardır. Kompleman örneğin C1q, C3, C4 ve C5 son derece dayanıksı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator