Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Özet

Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.

Özet

^Karaciğer, 1 hayatta kalmak için besin ve oksijen ve atıkların uzaklaştırılması teslimat için sürekli perfüzyon gerektiren karmaşık bir organdır . , Karaciğer mikroyapı, doku mühendisliği ve imalat teknikleri kullanarak bir yaklaşım gerekçeleri ile birlikte yeniden ya da taklit etmek için çabaları şimdiye kadar bu tasarım sorunu nedeniyle başarılı olamamıştır. Buna ek olarak, karaciğer doku mühendisliği uygulamaları için iskeleler oluşturmak için kullanılan sentetik biyomateryaller uygun hücre fonksiyonlarını ² neden belirli bir hücre bağlayıcı motifleri eksikliği nedeniyle büyük ölçüde doku rejenerasyonu ve onarım inducing sınırlı kalmıştır. Diğer taraftan Decellularized doğal dokular, kan damarları ³ ve ⁴ cilt, doku mühendisliği birçok uygulama var ve zorlukların bazı pratik bir çözüm sağladı . Decellularized yerli matris avantajı dolayısıyla hücre eki ve yeniden yapılanma ⁵ artırılması, bir ölçüde, orijinal kompozisyon ve mikroyapı korumasını.

Bu çalışmada biz büyük kan damarlarının yapısını korur sağlam bir karaciğer bioscaffold elde olduğu gibi, karaciğer perfüzyon decellularization, gerçekleştirmek için yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, in vitro fonksiyonel bir karaciğer grefti yetişkin birincil hepatositler bu bioscaffolds recellularize yöntemleri tarif ve in vivo nakli için gerekli damar erişimi vardır.

Protokol

1. Karaciğer Decellularization

1. Portal ven kanülasyonu ve 18-gauge kateter ile sıçan karaciğer Hasat. Inferior ve superior vena kava açık bırakın. Organ sulu tutun fosfat tamponlu salin (PBS) 10 cm'lik petri.
2. 8-litrelik rezervuar, peristaltik pompa ve bir baloncuk kapanı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun.
3. Perfüzyon sistemi doldurun fosfat tamponlu salin ve 10 dakika boyunca çalışmaya devam. 10 cm'lik petri kaplarına PBS doldurun ve fosfat akış hızı 1 ml / dk tamponlu salin azaltmak.
4. Dikkatlice hasat karaciğer transferi fosfat tamponlu tuzlu su dolu 10 cm'lik petri.
5. Gecede PBS perfüzyon ile devam edin.
6. Distile su içinde 5 dakika boyunca% 0,01 (w / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ile perfüzyon başlayın.
7. PBS ile 1 saat serpmek.
8. Her seferinde 10, 15 ve 20 dakika SDS perfüzyon süresi artan adımları 1.6 ve 1.7 üç kez daha tekrarlayın.
9. 24 saat boyunca% 0,01 (w / v) SDS ile perfüzyon devam edin.
10. 24 saat boyunca% 0.1 (w / v) SDS ile perfüzyon devam edin.
11. 3 saat boyunca% 0.2 (w / v) SDS serpmek.
12. 3 saat boyunca% 0.5 (w / v) SDS serpmek.
13. Distile su ile 15 dakika boyunca serpmek.
14. % 1 (w / v) distile su ile Triton X-100 ile bağlı herhangi bir nükleik asitlerin kaldırmak için 30 dakika boyunca serpmek.
15. Decellularized karaciğer matrisi (DLM), 2 saat süreyle PBS ile serpmek yıkayın.
16. İsteğe bağlı: median lob dışında bütün lobları rezeke.
17. Kullanmak için hazır (Şekil 1) kadar 4 ^o C'de PBS batırılmış temiz ve mühürlü bir Petri kabındaki DLM saklayın .
18. DLM sterilize etmek için: 1) steril PBS 4 ^o C'de% 0.1 (v / v) perasetik asit ve% 4 (v / v) etanol ve 3 saat inkübe içeren DLM yıkayın 2) steril PBS 2 kez yıkayın. 3)% 2 penisilin-streptomisin, 10ug / ml gentamisin ve 2.5 ug / ml amfoterisin B Store recellularization deneyler için kullanmaya hazır olana kadar 4 ^o C'de aynı çözüm decellularized karaciğer içeren steril PBS ile yıkayın.

2. Decellularized Karaciğer Matrix, Recellularization

1. Perfüzyon odası, peristaltik pompa ve steril koşullar altında bir baloncuk tuzağı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. 200 ml kültür ortamı, örneğin, yüksek glukoz DMEM (Sigma),% 10 fetal sığır serumu (Hyclone), 100 U mL ^-1 penisilin ve 100 mg ml ^-1 streptomisin (Invitrogen) ile perfüzyon sistemi doldurun.
2. Perfüzyon odasında decellularized karaciğer matris yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için 5 ml / dak pompa çalışırken portal ven kanül aracılığı ile perfüzyon sistemine DLM bağlamak.
3. 30 dakika boyunca DLM yoluyla orta perfüzyon izin verin.
4. En az% 90 canlılığı ile yetişkin bir fare primer hepatositlerde izole edin.
5. Perfüzyon sistemi akışını durdurun ve perfüzyon sistemine yavaş yavaş balonu tuzak üzerinden 50 milyon hepatositler (1-3 ml kültür ortamı) enjekte edilir.
6. 10 ml / dk akış başlayın ve 10 dakika boyunca orta sirküle.
7. DLM (Şekil 2) ⁶ olmak üzere toplam 200 milyon hücre içine tanıtıldı kadar 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın.
8. Bir kez tüm hücreleri DLM perfüze olan, 10 dakika boyunca 600 rpm'de dört adet 50-ml santrifüj tüplerine ve santrifüj perfüzat toplamak. Süpernatantlar atın ve tek bir tüp içine pelet toplamak. Tohumlama verimliliği belirlemek tripan mavi dışlama yoluyla hücreler ve canlılığı sayısını belirler.

3 Recellularized Karaciğer Greft Vitro Kültür

1. Perfüzyon odası, steril koşullar altında (Şekil 3) peristaltik pompa, oksijenatör ve bir baloncuk kapanı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. 50 ml kültür ortamı ile perfüzyon sistemi doldurun, örneğin, Williams 'E (Sigma),% 5 fetal sığır serumu (Hyclone), 0.5 U mL ^-1 insülin (Eli Lilly), 20 ng ^mL-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml ^-1 glukagon (Bedford Laboratories), 7.5 mg mL ^-1 hidrokortizon (Pharmacia), 100 U mL ^-1 penisilin, ve 100 mg mL ^-1 streptomisin (Invitrogen).
2. Perfüzyon odasında recellularized karaciğer greft yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için 5 ml / dak pompa çalışırken portal ven kanül aracılığı ile perfüzyon sistemine DLM bağlamak.
3. Aseptik perfüzyon odasına yakın ve kültür sırasında herhangi bir sızıntıyı önlemek için sıkı bir şekilde yapışması.
4. 37 ^o C ve% 10 CO bir kuluçka perfüzyon sistemi Transfer ₂ ve 15 ml / dak perfüzyon akım hızı artırmak.
5. % 95 O ₂ ve% 5 CO ₂ gaz karışımı tankı oksijenatör bağlayın ve gaz debisi 0.5 litre / dakikaya kadar ayarlayabilirsiniz. Bu approxima bir oksijen kısmi basıncı eldetely 400 mmHg.
6. Kültür, kültür ortamı günlük değişiklikler ile 10 gün kadar devam edebilir. Kültür ortamı, albümin, üre ve toplam safra asit salgılanması gibi greft, karaciğer fonksiyonlarının izlenmesi için günlük numune olabilir. Recellularized karaciğer greft kültür dönemi sonunda, moleküler ve histolojik analiz için numune olabilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Sıçan karaciğer decellularization açıklanan protokolünü kullanarak yaklaşık 72 saat sürer. Ortaya çıkan matris,% 100, fibriler kollajen glikozaminoglikanlar% 50 ve sadece% 5 yerli karaciğer DNA (Tablo ¹⁾ 6 korur . Matrisin vasküler yapı korozyona döküm ve taramalı elektron mikroskobu analizi (Şekil 4) ⁶ kanıtladığı gibi korunur. DLM içinde vasküler mikromimarisinin varlığı,% 96 verimlilik ve in vitro kültür için bir sonraki perfüzyon hücreleri ile repopulation kolaylaştırır. Recellularized karaciğer greft in vitro olarak 10 gün kadar kültürlü ve albümin, üre ve toplam safra asit salgılanması (Şekil 5) ⁶ üzerinden teyit uygun karaciğer fonksiyonları görüntüler olabilir.

Şekil 1 decellularization süreç sonunda karaciğer matris Decellularized. (A) tüm karaciğer rezeksiyonu sonrası (b), medyan lobu.

Şekil 2 DLM recellularization şematik.

Şekil 3 recellularized karaciğer greft in vitro kültürü Perfüzyon sistem kurulumu.

Şekil 4 mikrovasküler yapıyı decellularized karaciğer matris korunur. A) normal karaciğer b) decellularized karaciğer, portal (kırmızı) ve venöz (mavi) damarsal Korozyon döküm görüntüler. Tarama elektron mikroskobu görüntüleri DLM c) Bir gemi, d) safra kanalı gibi küçük damarlarda (oklar), Ölçek çubukları (a, b) 5 mm (c, d) 20 mikron bir bölüm.

Şekil 5 in vitro perfüzyon kültür sırasında recellularized karaciğer greft Karaciğer özel fonksiyonlar . a) albümin sekresyon (p = 0,5249), b) üre üretimi (p = 0,5271) ve c) toplam safra asit salgılanması (p = 0,0114). A = 0.01 Friedman testi ile 10 gün kültür dönemi boyunca deney ve kontrol arasındaki fark istatistiksel analizi yapıldı. Hata çubukları sem (n = 3) temsil eder.

	Taze livera	Decellularized karaciğer matris	p-değerleri	% Taze karaciğer
	n = 4	n = 8
Kollajen	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0,56	% 114
(G karaciğer mg)
Glikozaminoglikanlar	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0,004	% 47
(G karaciğer mg)
DNA	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10 -5	% 2.9
(G karaciğer mg)

(Tablo 1). Decellularized karaciğer matris biyokimyasal bileşimi yerli karaciğer göre.
^Değerler ortalama ± sem olarak temsil edilir

Tartışmalar

Burada açıklanan perfüzyon decellularization yöntemi aynı brüt yapısı ve yerli karaciğer vasküler mikromimarisini bir bütün karaciğer iskele üretir. Iskele yerli karaciğer benzer bir ekstrasellüler matriks kompozisyonu vardır. Recellularization yöntemi, yüksek verimliliği ve hücrelerin hücreleri in vitro kültür dönemde test sırasında uygulanabilir ve işlevsel kalır iskele repopulation ulaşır . Recellularized karaciğer dokusuna nonparenchymal hücrelerinin yanı sıra, bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149