Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Özet

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Özet

Son zamanlarda, yapısal ve biyokimyasal çalışmalarda birçok ribozom antibiyotikler ile protein sentezi inhibisyonu sırasında ve doğmakta olan polipeptid sentezi sırasında meydana gelen moleküler olayların detaylı var. Bazı antibiyotikler, ve çoğunlukla peptidil-tRNAs formu düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin, peptid bağı oluşumu veya çeviri fesih ^1-7 inhibe ederler. Bu inhibitör olaylar ribozom hareketi durdurmak, bir fenomen "translasyon tutuklama" olarak nitelendirdi. Bir antibiyotik ya da olgunlaşmamış bir polipeptid ya indüklenen Çeviri tutuklanması, hücre büyümesi, antibiyotik direnci, protein translokasyon ve ^hücre metabolizması 8-13 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları yer alan genlerin ifade düzenleyen gösterilmiştir. Biz her organizma çeviri ribozom tam rolü, anlamak istiyorsak, antibiyotik ve düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin ribozom fonksiyonu nasıl değiştirdiğini Bilgi esastır.

Burada, biz, sadece arındırmak analiz için, bu ribozom belirli bir mRNA'nın çeviri ve belirli bir peptidil-tRNA ¹⁴ içeren kullanılan basit bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu prosedür, biotin etiketli mRNA bağlı ribozomlar tercüme selektif izolasyon dayanmaktadır. Bu translasyonel kompleksleri streptavidin paramanyetik boncuk (SMB) ve (MF) bir manyetik alan kullanarak, aynı karışımı diğer ribozom ayrılır. Biotin-etiketli mRNA'ların T7 transkripsiyonel rehberleri içeren şablonları PCR oluşturulan DNA parçaları kullanarak run-off transkripsiyon analizleri ile birleşiyor. T7 RNA polimeraz biotin UTP biotin-16-UMP içeriyor; koşullar altında yaklaşık on biotin-16-UMP moleküllerinin% 25 UMP içeriği ile 600 nt mRNA dahil edilmiştir. Bu biotin etiketli mRNA'ların sonra izole ve serbest faktör 2 (RF2) ile yapılan in vitro çeviri deneylerde kullanılan tükenmiş yabani türü veya mutant ribozom içeren Escherichia coli suşlarının elde edilen hücre özleri. Biotin etiketli mRNA dizileri çevirirken Ribozomlar, normalde çeviri fesih gerçekleştirir RF2 protein, olmaması nedeniyle, stop kodon bölgedeki sekteye uğruyor. Yeni sentezlenmiş peptidil-tRNA içeren durdu ribozomlar izole ve SMB ve MF kullanarak çeviri reaksiyonlar kaldırılır. Bu boncuklar sadece biotin içeren mesajlar bağlanır.

Izole, translasyonel kompleksleri, vahşi tip ya da mutant ribozomal bileşenleri, veya peptidil-tRNA dizilerinin yanı sıra, antibiyotik veya diğer moleküler faktörler ^1,14-16 ribozom etkileşim belirleyen yapısal ve fonksiyonel özelliklerini analiz etmek için kullanılabilir. Bu izole ribozom kompleksleri fonksiyonunu incelemek için, peptidil transferaz deneyleri, antibiyotik ^puromycin 1 varlığında yapılabilir . Translasyonel komplekslerinin yapısal değişiklikleri incelemek için, iyi kurulmuş prosedürler belirli amino asitleri ¹⁴ ve / veya ii) alkilleme koruma deneyleri ^1,14,17) i olarak, crosslinking kullanılan olabilir.

Protokol

1. Hücre Ücretsiz Özü hazırlanması.

1. İki pelet bakteriyel bir kuru Escherichia coli gram orta-log faz kültürler tampon yarım litre ile iki kez yıkanır elde edilen A içeren 10 mM Tris-asetat, pH 8.0, 14 mM magnezyum asetat, 60 mM potasyum asetat ve 50 mg 5000 X g de 5 dakika santrifüj 4 / ml phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) ° C Yıkadıktan sonra, bakteriyel pelet tampon A. 40 mL yeniden süspanse
2. Bakteri hücrelerinin 6000 psi basınç uygulayarak, bir Fransız Basın kullanarak etkileniriz. Bu basınç, 600 adet bir-inç piston kullanarak karşılık gelir. Kesintiye süspansiyon temiz bir cam tüp (50 ml) toplanır.
3. Kesintiye süspansiyon 1 mM dithiotreitol (DTT) ile tedavi edilir ve 30 dakika 30.000 xg'de santrifüj. Meydana gelen supernatant kullanarak, santrifüj işlemi tekrarlanır. Son süpernatant mikrotüpler (1 ml) sürülür. Son olarak, alikotları, kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen kullanılarak dondurulur ve -60 saklanır ° C veya -80 ° C

2. RF2, Tüketilmiş Hücre ayıklar hazırlanması.

1. Protein A sepharose 4B bulamaç boncuk 4,5 ml 5 ml, bir saat, oda sıcaklığında dönen bir tekerlek kullanarak bir anti-RF2 anti-serum ile karıştırılır. Karışımı antiserum boncuklar ayrı xg 2500 santrifüj edilir. Süpernatantı atılması üzerine, anti-RF2 antikorları (anti-RF2 boncuk) içeren bu boncukları daha sonra 1 ml 35 mM içeren tampon B tabanda tarafından yıkanır Tris-asetat, pH 7.8, 10 mM magnezyum asetat, 30 mM amonyum asetat, 60 mM potasyum glutamat ve 5 mg / ml leupeptin proteinaz inhibitörüdür. Anti-RF2 boncuk sonra santrifüj kullanarak aynı koşullar yukarıda belirtilen tampon B ayrılır. Yıkama işlemi iki kez tekrarlanır.
2. Bir mL hücre özü 4, dönen bir tekerlek kullanarak anti-RF2 boncuk 150 mcL ile karıştırılır ° C, iki saat boyunca. Karışımı boncuklar hücre özü ayrı 10.000 xg'de santrifüj edilir. Süpernatant 150 mcL başka bir anti-RF2 boncuk ile tekrar kaldırılır ve tedavi edilir. Bu prosedür ortaya çıkan hücre özü çözümü ile bir kez daha tekrarlanır. Son hücre ekstresi solüsyonu (100 mcL) mikrotüpler içine dağıtılır. Alikotları, kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen ile dondurulur ve -60 saklanır ° C veya -80 ° C

3. DNA Şablon hazırlanması.

1. Şekil 1, her dNTP 0.2 mikromolden ve 50 U belirtilen oligodeoxynucleotides her birinin 0.4 nanomol ile karıştırma 600 femtomoles dizileri tercüme içeren plazmid şablonu (Şekil 1) 1 ml PCR reaksiyon hazırlayın Taq- Stratagene A.Ş. tarafından verilen tampon DNA polimeraz amplifikasyon reaksiyon aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirin: 94 ° C, 2 dakika süreyle (94 ° C - 30 s, 55 ° C - 30 s, 72 ° C 1 dakika için; 30 siklus) ve 72 ° C 12 dak.
2. 1 / 10, 3 M sodyum asetat hacmi, pH 5.2 ve buz gibi soğuk etanol 2 cilt ekleyerek DNA presipite PCR ürünleri arındırın. Yağış prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Dietil-pyrocarbonate (DEPC) tedavi su 100 mcL DNA tekrar
   Tipik olarak, bu yordamı 100 mikrogram 600 bp DNA ürün verir.
3. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile bütünlüğünü doğrulayın.

4. Biotin Etiketli mRNA hazırlanması.

1. 5 mikrogram, ATP, CTP, GTP, UTP 0,3 mikromolden, biotin-16-UTP 50 nanomol, ve 10 mcL 0.5 mikromolden ile oluşturulan PCR-DNA parçasının karıştırma DEPC arıtılmış su in vitro transkripsiyon reaksiyon 100 mcL hazırlayın Promega A.Ş. tarafından verilen tampon T7 enzim karışımı reaksiyon karışımı 37 ° C'de 3 saat.
   Elde edilen mRNA miktarını ölçmek için, DNA şablonu RNaz-ücretsiz DNaz ekleyerek ortadan kaldırılmalıdır. 37 ° reaksiyon ° C 'de 10 dakika inkübe edin.
2. 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve 2 cilt soğuk etanol eklenerek RNA presipite mRNA ürünleri arındırın. Yağış prosedürü bir kez daha tekrarlayın. DEPC tedavi su 100 mcL mRNA tekrar
   Genellikle, 600 nt biotin 1-2 mg arasında bu usul verimleri mRNA ürün olarak nitelendirdi.
3. Biotin etiketli mRNA ürünleri agaroz jel elektroforezi ile bütünlüğünü doğrulayın.

5. Çeviri Ribozomlar İçeren Peptidil-tRNA izolasyonu.

1. 75 nanomol her on dokuz amino asit-radyoaktif bir amino asit, amino asit dışında yerini olacağını 10-15 mikrogram biotin etiketli mRNA karıştırma DEPC arıtılmış su in vitro çeviri reaksiyon karışımı bir 500 mcL hazırlayın , radyoaktif bir amino asit (37MBq) μCi, 50 ve 20-5 0, 40 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM magnezyum asetat, 175 mM potasyum asetat, 10 mM amonyum asetat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 içeren bir tampon reaksiyon karışımı RF2-tükenmiş hücre özü, mcL GTP mM, 30 mM fosfoenolpiruvat (KEP), 0.3 U / mL pirüvat kinaz (PK),% 3.5 polietilen glikol 8000, 1 mM spermidin, 20 mcg / mL folinik asit ve 250 mg / ml tRNA ( E.) coli. Reaksiyon karışımı 37 ° C'de 10 dakika.
   Reaksiyon bileşenlerinin yanı sıra sırası çok önemlidir. Hücre özü, amino asitler ve ribozomların aktivasyon izin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe son karışımı içeren tampon çözelti ile karıştırılmalıdır. Daha sonra, biotin etiketli mRNA'ların eklenir. Kimyasal modifikasyonu prosedürleri kullanarak yapısal analizler için, radyoaktif bir amino asit eklenmesi gerekli değildir.
2. - Çeviri Reaksiyon karışımı içeren 35 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM magnezyum asetat, 175 mM potasyum asetat, 10 mM amonyum asetat ve 1 mM DTT tampon C askıya streptavidin paramanyetik boncuk (SMB), 3 mL ekle. Yeni süspansiyon oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
3. Manyetik ayırma standları kullanarak bir manyetik alan (MF) uygulayarak karışımı SMB ayırın.
4. Tampon C SMB yeniden süspanse ve MF kullanarak tekrar boncuklar ayrı. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlayın. Tampon C 500 mcL boncuk süspanse edin, buz süspansiyon saklamak ve hemen sonraki yordamı gerçekleştirmek.

6. İzole Ribozomlar Peptidil-tRNA İçeren Analizi.

Peptidil-tRNA için

1. 50 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 2.5 (v / v) gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat, 2 mM DTT ve 0.2 mg içeren bir yükleme tamponu 10 mcL SMB 10 mcL Mix (tampon C askıya) / ml Bromophenol Mavi. Örneklerin% 10 Tris-tricine poliakrilamid jeller çalıştırarak boncuklar bağlı bileşenleri giderin.
2. Jeller bir vakum jel kurutma makinesi ile kurutun.
3. X-ray film kurutulmuş jel açığa peptidil-tRNA bütünlüğünü ve saflaştırma olun.

Ribozomal RNA

4. DEPC arıtılmış su ile hazırlanan 2 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solüsyonu 190 mcL ve 10 mcL boncuk süspansiyonu, su ile fenol dengelenmiş 200 mcL ekleyin. Dinç vorteks süspansiyon karıştırın ve oda sıcaklığında 3 dakika 10.000 xg'de santrifüj organik faz inorganik faz ayrı. Yeni bir mikrotüp üst su tabakası toplayın.
5. 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2, 20 mg / ml, glikojen çözüm ve buz gibi soğuk etanol 2 cilt 1 mcL ekleyerek su tabakası RNA çöktürün. RNA 10 mcL DEPC arıtılmış su tekrar
6. Agaroz jel elektroforezi ile ribozomal RNA'lar bütünlüğünü doğrulayın.
   Genellikle, boncuk süspansiyon 50 mcL ribozomal RNA 1μg verir.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 2 özetlenen yordamı kullanarak izole tercüme ribozomların kalite ve işlevsellik değerlendirilmesi analizler bir dizi sonuçlarını göstermektedir. Poliakrilamid jeller çözülmesi eşsiz bir grup gözlem SMB (Şekil 2A) bağlı biotin etiketli mRNA'ların bağlı polipeptidlerin varlığını gösterir. Bu yordamı kullanarak arıtma ribozomal RNA'lar ribozomların yanı sıra, bu biotin etiketli mRNA'ların bağlı (Şekil 2B) varlığı kurar. Puromycin Buna ek olarak, bir antibiyotik ribozom peptidil-transferaz aktivitesine yol, doğmakta olan peptidil tRNAs ¹ bölünme. Bu bir değişim (Şekil 2C) poliakrilamid jeller izole polipeptid göç desen olarak görülmektedir. Birlikte, bu veriler SMB 'ye bağlı biotin etiketli mRNA'ların peptidil-tRNAs ile fonksiyonel ribozomlar içerdiğini göstermektedir.

Ribozom fonksiyonu (Şekil 3A), özel peptidil tRNAs içeren tercüme ribozomların izolasyon peptidil-tRNAs, antibiyotik ve diğer moleküllerin etkilerini çalışma izinleri, ribozom yapısı (Şekil 3B). Antibiyotik sparsomycin burada örnekler sundu ve amino asit olan triptofan (Trp) izole ribozomlar (Şekil 3A) RF2 doğmakta olan tnaC-tRNA peptidil-tRNA indüklenen hidrolitik bölünme inhibe. Ribozom sparsomycin veya Trp etkileşim de tercüme Ribozom (Şekil 3B) 23S rRNA oluşturan bazı nükleotidlerin yapısal değişikliklere neden olur. Özetle, prosedür kullanılarak elde edilen biyolojik materyalin moleküler çeşitli faktörler ile etkileşimi üzerine ribozom fonksiyonu inhibisyonu dahil yapısal temas ek anlayış elde edilmesinde yararlı Burada anlatılan.

ove_content ">
Şekil 1 peptidil-tRNAs içeren tercüme ribozomlar üretmek ve arındırmak için kullanılır Usul. DNA parçalarının ca. Şekilde gösterildiği tnaC gen ve bitişik bölge, içeren, uzunluğu 650 bp, biotin, [(biyo) UMP] mRNA içeren mRNA'ların hazırlanıyor şablon olarak kullanılır . Bu DNA parçalarının rakamın üstündeki belirtilen oligodeoxynucleotides kullanarak PCR prosedürleri ile üretilmektedir. Altı çizili harf nükleotid astar olarak kodlanmış T7 organizatörü yerini işaretleyin. Kalın harfler tnaC mRNA dizilerinin çeviri kullanılan Parlatıcı Dalgarno dizisi göstermektedir. DNA parçası T7 organizatörü tnaC sırası ve kodlama sırası downstream yazıya (ok) için kullanılır T7 RNA polimeraz tarafından kabul edilmektedir. RNA polimeraz rpoBC terminatör dizileri (rpoBC "t") sonra, DNA parçasının 3'-sonuna ulaştığında Transkripsiyon sonlandırıldı. RpoBC terminatör kök döngü yapısı, in vitro çeviri reaksiyonlarda kullanılan hücre ücretsiz özleri 3'-5 'exoribonuclease aktivite mevcut mRNA korur. Izole [(biyo) UMP] mRNA'ların in vitro çeviri deneyleri kullanarak durdu, tercüme ribozomlar oluşturmak için kullanılır . TnaC dizisi [(biyo) UMP] mRNA reaksiyon karışımının Release Faktörü yokluğu (RF2) nedeniyle son amino asit dahil edildiğinde duraklarına bir ribozom tarafından tercüme edilir. Ribozom [(biyo) UMP] mRNA kompleksleri mRNA dahil biotin etiketli nükleotidler bağlayan streptavidin manyetik boncuk (SMB) kullanarak toplam reaksiyon karışımından izole edilmiştir. KOBİ'ler bağlı ribozom-[(biyo) UMP] mRNA kompleksleri, bir manyetik alanı (MF) kullanarak toplam reaksiyon karışımı elde edilir.

Şekil 2 izole komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel analizleri. A) in vitro çeviri reaksiyonlar ile yapıldı [(biyo) UMP] mRNA'ların tnaC genin başlangıç ​​kodon bir stop kodon tarafından değiştirildi. Nihai ürünler Şekil 1'de belirtildiği gibi, streptavidin boncuk kullanılarak izole edildi. Reaksiyon ürünleri ve izole moleküller sonra poliakrilamid jeller elektroforezi ile analiz edildi. TnaC-tRNA ve tnaC peptid bantları işaretlenmiştir. B) Toplam RNA fenol çıkarma prosedürleri kullanarak durdu kompleksleri izole edilmiştir. Her izole RNA agaroz jel elektroforezi ile çözüldü. Ribozomal RNA (rRNA) gösterilir. C) tnaC-tRNAs içeren İzole kompleksleri ile (+) ya da inkübe edildi (-) 10 dakika oda sıcaklığında 0.02 mM puromycin (Puro). TnaC peptid [35S]-metionin (A) veya [3H]-prolin (B) kullanarak çeviri sırasında etiketli.

Şekil 3 antibiyotik sparsomycin veya amino asit olan triptofan bağlı ribozomlar tnaC-tRNA içeren yapısal ve fonksiyonel analizleri. A) tnaC tRNAs içeren İzole kompleksleri ile (+) veya (olmadan inkübe edildi -) sparsomycin (Spar) veya 5 dakika süreyle oda sıcaklığında triptofan (Trp). Daha sonra, karışım RF2 ile karıştırılır ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edildi. B) 23S rRNA metilasyon değişikliklerini analizi ribozom içinde bağlayıcı molekülleri tarafından uyarılan. İzole kompleksleri ile (+) ya da önceden inkübe edildi (-) 2 5 dakika boyunca 37 mM Trp veya Spar ° C Sonra bir alkilleme ajan, dimetil sülfat, eklenir ve karışım ilave bir 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Total RNA ekstrakte edildi ve astar uzantısı deneyleri [32P] değiştirilmiş nükleotid downstream 100 nükleotidler aralıklı 23S rRNA nükleotidler tamamlayıcı etiketli oligodeoxynucleotide ile yapıldı. Uzatma testlerinin son ürünleri poliakrilamid jel elektroforezi tarafından çözüldü. Trp veya Spar varlığı ile etkilenen 23S rRNA nükleotidler gösterilir.

Tartışmalar

Bu raporda açıklanan Bu izolasyon prosedürü yeniden üretilebilir niteliktedir. Ne yazık ki, aynı tercüme dizileri üretilen kısa peptidil-tRNAs varlığı uygun kaçınılmalıdır; böyle peptidil-tRNAs toplam izole malzeme (Şekil 2C)% 15-20 oranında karşılık gelebilir. Bu kirleticiler, biotin etiketli mRNA yüksek konsantrasyonlarda kullanılan ya da kullanılan hücre özü, eski ya da birkaç kez tekrar edilmiştir konsantrasyon artırabilir. Bu nedenle, in vitro çeviri reaksiyonlarda bileşenleri kalite ve konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemlidir . Alternatif olarak, ticari yüksek verim sulandırılmış hücre özleri, aynı amaçlar (PURE ^sistemi) 18 için kullanılabilir mevcuttur .

Bu yöntemi kullanarak, biotin-16-UMP rastgele hedef mRNA uzunluğu boyunca kurulmuştur. Üridin yolları içeren bazı Orfs kendi çeviri etkileyen, dizileri nükleotid değiştirilmiş dahil olabilir olasılığı vardır. Biotin-16-UTP/UTP değişken, göreceli konsantrasyonların mRNA sentezi sırasında en etkili çeviri elde etmek için test edilmesi gerekir. MRNA'ların 5'-sonunda, en istikrarlı sonuna hedefleyen, biotin etiketleme alternatif yöntemler kullanılabilir. (I) Biotin, 3'-NH2ATP (3'-amino, 3'-deoksiadenozin trifosfat) ve T4 RNA ^ligaz 19 mRNA 5'-end eklenebilir . (Ii) 5'-biotin-etiketli oligonükleotid yanı sıra ²⁰ T4 RNA ligaz kullanarak mRNA'nın 5'-sonuna kadar eklenebilir. (Iii) mRNA'nın 5'-sonunda tamamlayıcı dizisine karşılık 3'-ucundaki biotin etiketli oligodeoxynucleotides tercüme kompleksleri da izole etmek için kullanılır olabilir. Bu biotin etiketli oligodeoxynucleotides izolasyon önce SMB bağlı olabilir. Daha sonra onların tamamlayıcı mRNA dizileri ile etkileşime olanak çeviri reaksiyon karışımı ile SMB karışık olabilir biotin etiketli oligodeoxynucleotides bağlı. Izolasyondan sonra melez RNA-DNA bölge ve bölge biotin etiketli oligodeoxynucleotide ve mRNA dizisi arasındaki literatürde - RNAse H kullanarak bozulmuş olabilir, streptavidin boncuk durdu kompleksleri ayıran. Bu alternatif yöntem, kompleksleri, yüksek çözünürlüklü yöntemler kullanılarak geleceğe yönelik yapısal analizlerde istihdam edilmek üzere izin verebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris base	Sigma-Aldrich	252859
Magnesium acetate	Fluka	63049
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1501
Ammonium acetate	Fluka	09688
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Protein A sepharose 4B slurry beads	Sigma-Aldrich	P9424
Leupeptin inhibitor	Sigma-Aldrich	L9783
Taq-DNA polymerase	Stratagene, Agilent Technologies	201223
T7 Maxiprep kit	Promega Corp.	P1300
SMB	Promega Corp.	Z5482
Biotin-16-UTP	Roche Group	1388908
ATP	Sigma-Aldrich	A7699
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
PEP	Sigma-Aldrich	P7002
PK	Sigma-Aldrich	P7768
Polyethylenglycol 8000	Fluka	81268
Folinic acid	Fluka	47612
Spermidine	Fluka	85558
tRNA from E. coli	Sigma-Aldrich	R1753
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Tricine	Sigma-Aldrich	T5816
L-amino acids	Sigma-Aldrich	LAA21
DTT	Fluka	43815
magnetic separation stands	Promega Corp.	Z5342