İzole Renal Arter Tıkanıklığı Asılı ağırlık Sistemi

Özet

Iskemi nedeniyle akut böbrek hasarı için kesin bir fare modeli (AKI), akut böbrek hasarı incelemek ve muhtemelen böbrek hasarı tedavi etmek için tedavi araçları bulmak için önemli bir araçtır. Asılı ağırlık sistemi, böbrek tıkanıklığı neden olmadan, hızlı ve güvenilir renal arter oklüzyonu ve reperfüzyon bir araç sunuyor.

Özet

Hastanede yatan hastalarda akut böbrek hasarı (AKI) vakalarının% 50'den fazla ^1-3 renal iskemi neden olur. Hastanede yatan hastalarda yakın zamanda yapılan bir çalışmada, serum kreatinin düzeyleri, sadece hafif bir artış (0,3 ila 0,4 mg / dl) herhangi bir artış ^olmadan 1 kişi daha ölüm riski% 70 daha fazla ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Bu doğrultuda, cerrahi işlemler gerektiren çapraz sıkma aorta ve böbrek damarları, böbrek yetmezliği ^oranları% 4 ila 30 kadar bir ile ilişkili . Benzer şekilde, kalp cerrahisi sonrası AKI, normal şartlar altında hastaların% 10'un üzerinde oluşur ve mortalitede dramatik artışlar ile ilişkili. AKI da karaciğer transplantasyonu sonrası sık görülen komplikasyonlar. Hastaların en az% 8-17, renal replasman ^tedavisi 5 gerektiren sonuna kadar . Ayrıca, böbrek nakli sırasında tübül hücre hasarı nedeniyle gecikmiş greft fonksiyonu, sık sık iskemi ile ^ilişkili AKI 6 ile ilgili. Ayrıca, AKI sepsis ⁶ muzdarip hastaların yaklaşık% 20 oluşur. AKI oluşumu, morbidite ve ^mortalite 1 dramatik artışlar ile ilişkilidir . Terapötik yaklaşımlar oldukça sınırlıdır ve insanlarda AKI girişimsel çalışmaların çoğunluğu başarısız oldu. Bu nedenle, iskemi böbrek hasarı önlemek için ilave tedavi yöntemleri acilen ^{7-9, 3} ihtiyaç vardır.

Iskemi nedeniyle renal hasar mekanizmaları ve olası tedavi stratejileri fare modelleri aydınlatmak için yoğun ^7-13 gereklidir. Fare modelleri gen hedefli fareler ve doku spesifik gen hedefli farelerde (CRE-Flox sistem) de dahil olmak üzere farklı genetik modeller kullanma imkanı da sağlar. Ancak, fare iskemi, teknik açıdan zor ve deneysel ayrıntıları belirgin sonuçları etkileyebilir. Biz özellikle renal pedikül ¹⁴ sıkma veya sütür kullanımı önler farelerde izole renal arter tıkanıklığı, bir roman modeli sistematik bir değerlendirme yapıldı. Bu model, iskemi sadece deneysel ayar nedeniyle bir böbrek yapılabilir beri sağ böbreğin bir nefrektomi gerektirir. Aslında, Asılı ağırlık sistemi kullanılarak, renal arter sadece enstrümante cerrahi işlem boyunca sonra. Buna ek olarak, venöz veya üretral obstrüksiyon Bu tekniği ile oluşur. Biz serum kreatinin ölçerek iskemi zaman doza bağımlı ve yüksek tekrarlanabilir renal hasar göstermelidir. Ayrıca, bu yeni model tüm pedikül, böbrek koruma iskemik ön tarafından geleneksel sıkma karşılaştırırken, daha derin ve daha güvenilir. Bu nedenle onun yeni bir teknik akut böbrek hasarı alanında çalışan diğer araştırmacılar için yararlı olabilir.

Protokol

Genel notlar Tüm işlemler dik bir diseksiyon mikroskobu (Leica) altında bir cerrahi koagülatör ile yapılmalıdır. Deney grupları fareler sonuçlarının karşılaştırılabilirliği sağlamak için, yaşları ve kiloları ile uyumlu olmalıdır. Sıcaklık, kan basıncı, anestezi ve sıvı yönetimi, deney sırasında istikrarlı ve takip edilmelidir.

1. Anestezi ve cerrahi

1. Böbrek iskemi deneyler ya da aynı anda hem böbreklerde iskemi ve reperfüzyon uygulayarak ya da kalan böbrek iskemi tedavisi ile birlikte tek nefrektomi sonrası ile yapılabilir. Her iki böbreğin ikili iskemi tedavisi artan teknik zorluklar, daha karmaşık bir deneysel ayarı ve daha uzun cerrahi ile ilişkili olduğu için, biz kalan sol böbrek iskemi tedavisi ile asılı ağırlık sistemi kullanılarak sağ nefrektomi gerçekleştirecektir. Biz kalp koroner arter oklüzyonu için de bu asılı ağırlık sistemi kullanılmıştır. Ancak, prosedür, koroner arter, kalp kası içinde yatıyor ise renal arter çevreleyen dokudan izole edilebilir beri farklıdır.
2. Fare (8-14 yaş hafta boyunca, her iki cinsiyetten) bir doz 70mg/kg pentobarbital ile anestezi olacaktır. Biz yaklaşık anestezi koruyacaktır. Pentobarbital 10 mg / kg / h sodyum. Doz aşımında, kan basıncı önemli ölçüde düşürebilir ve böylece sonuçları değiştirebilir. Bizim ilk çalışmalarda biz de Ketamin ve ksilizin kullandı. Ancak, bu bileşiklerin güçlü bir bradikardi (150 / dk) kaynaklı. Gözlenen bradikardi yanında iki bileşikler iskemi koşulları esnasında koruyucu mekanizmalar yer olduğuna dair kanıtlar da vardır. Uçucu anestezikler ya da böbrek koruma ve düşük kan basıncına neden yeteneği nedeniyle kullanılamaz. Bu nedenle anestezi için son seçim pentobarbital oldu. Buna ek olarak, ketamin ve ksilizin öncelikle böbrekler tarafından atılır. Nefrektomi ve iskemi ketamin anestezi süresini uzatabilir.
3. Bir kez ağrı refleksleri (cımbız ayak parmakları sıkarak test) farelerde sol lateral dekübit pozisyonda (RT, Effenberg, Münih, Almanya 37.0 ° C vücut ısısını korumak için), sıcaklık kontrollü bir ısıtma tablo üzerine yerleştirilir olacaktır.
4. Bant kullanarak tablo alt ve üst ekstremite takın.
5. Video gösterimi gösterildiği gibi hayatta olmayan ameliyatlar için mineral yağ, deri keserek fare saç teneffüs önlemek ve böylece fare saç alerji riskini önlemek için insizyon alanı kapsayacak. Sağkalım deneyler durumda saç iyodoforlar (örneğin Betadine), otoklavlanmış aletlerin steril taşıma ve cerrah için maskeler kullanarak steril eldiven, deri dezenfeksiyonu kırpma da dahil olmak üzere uygun aseptik teknikler gereklidir. Mineral yağ, hayatta kalma ameliyatlarında kullanılan değildir. Sağkalım ameliyatları için steril NaCl kullanılır
6. Sağ kanadını kesi, kanama, kas ve deri damarlarının önlemek için bir makas ve bir pıhtılaşma elektrot (Erbe, ICC50, Almanya) ile yapılacaktır. Orta hat laparotomi yoluyla böbrekler erişim aksine, bu teknik periton boşluğuna erişim gerektirmez.
7. Renal arter ve renal ven de dahil olmak üzere böbrek pedikül 4 / 0 ipek sütür ve sağ böbrek, adrenal gemi ile müdahale olmadan bir makas ile kesilir kullanarak bağlandı.
8. Cerrahi yara, kas duvarı ve cilt 4 / 0 sütür ile devamlı sütür (iki dikiş) kullanarak kapalı.
9. Hayvanlar daha sonra, bir sağ lateral dekübit pozisyonda yerleştirilir ve sol kanadını kesi yapılacaktır.
10. Sol böbrek, adrenal bezin ve damarlar dikkatle kaçınarak, bağ dokuları çıkarılır.
11. Sonra, böbrek Lucite kabına ventral yüzü aşağı açıktır. LUCITE fincan, hayatta kalmak ameliyatları için sterilize edilmelidir. Böbrek kutuplu bir forseps ile çevresindeki doku tutarak dikkatlice Lucite kap içine itilir. Bundan kutuplu bir forseps ile dikkatlice Lucite kap içine itilir. Böbrek 37.0 su ile ıslatılmış ıslak bir çubukla ° C ıslak ve sıcak tutulacaktır
12. , Sol böbrek ve yerleştirme Lucite bir kap içine maruz kalma böbrek sahibi ventral ölçülü böbrek damarları üzerinde bir gerilim var. Renal arter altında dikiş başarılı bir yerleşim için yeterli frenleyici önemlidir. Bundan sonra böbrek sahibi sabittir ve renal arter, renal ven üstünde çalışır gibi kolayca tespit edilebilir.
13. Renal arter, take-off ince forseps ile abdominal aorta, yakın komşu dokulardan disseke edilir. Arter kavisli bir forseps ile en üst kısmında altta yatan ven disseke edilir.
14. 8 / 0 ipek sütür (Ethicon, Norderstedt, Almanya) kullanılarak renal arter altına yerleştirilirlider bir rehber olarak bir forseps. Bu teknik, renal pedikül sıkma kıyasla renal ven sıkıştırma olmadan böbrek yalnızca arteryel kan akımı kesintiye olanak sağlar.
15. Dikiş küçük bir kutup (hazırlanmış bir emniyet pimi olabilir) ve yaklaşık bir kilo üzerine yerleştirilir. 1g (Eppendorf tüp), her iki ucuna da takılır. Yaptırmayı ya da Eppendorf tüpleri içine su ilave ağırlık böbrek boyutuna adapte edilebilir. Ancak, arter kan arter yoluyla değil, arter üzerinde büyük streç olmadan çalışan böylece biraz yukarı çekti olmalıdır. Arter üzerinde önemli streç stres arter duvarında kalınlaşma ve azaltılmış reperfüzyon ile damar duvarında hasara neden olabilir.
16. Ağırlıkları desteklenmeyen olsa da, hemen renal arter tıkalı. Buna karşılık, ağırlıkları desteklenmektedir, kan akışını organ hemen geri. Başarılı oklüzyon kırmızı beyaz renk değişikliği ile teyit edilir.
17. Farklı iskemi kez deney gereği yapılabilir. Tam bir reperfüzyon iskemi süresinin uzunluğuna bağlı olarak yer alacaktır. 45 dakika İskemi kez geri kazanılabilir böbrek hasarı izin verir. Deneysel ayarlarında iyileşme yanı sıra fare gerginlik ve tedaviye bağlı olarak böbrek hasarı değer düşüklüğü görmek için bize izin veren bir orta böbrek hasarı ile 30 dakika iskemi 20 kadar kullanılır.
18. Tam reperfüzyon sonrası böbrek Lucite fincan değiştirilebilir. Bu nedenle böbrek sahibi Sabitlenmemiş ve böbrek üzerindeki gerilim serbest bırakılır. Kranial kutup mülayim bir forseps ile yavaşça fincan kaldırılır ve kaudal kutup hemen aşağıda.
19. Fare fiksasyonu (bantlar) açığa çıkabilir ve fare örneğin FITC inulin etiketli açıklık için yatar pozisyonda yerleştirilebilir.
20. Deney grupları için, kan basıncı ve kalp hızı cerrahi işlem boyunca kaydedilebilir. Kan basıncı ölçümleri, karotis arter kateter yoluyla sürekli olarak elde edilir. Kısaca, karotis arter paratrakeal kasların künt diseksiyon ile maruz kalmaktadır. Daha fazla maruz kalma ve doku travması (özellikle vagal sinir) dikkatli kaçınma ardından, iki sütür ve küçük bir kelepçe kullanılarak damar içine bir kateter yerleştirilir. Kan basıncı Statham elemanı (WK 280, WKK, Kaltbrunn, İsviçre) ile ölçülür.
21. FITC etiketli inülin klirensi için bir kateter, sodyum klorür ve FITC etiketli inülin infüzyon için juguler ven içine konulmalıdır. Ayrıca mesane kateteri aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi zamana bağlı bir biçimde idrar toplama eklenecek.

2. Böbrek yaralanma ölçümü

1. Genel olarak şu sonuç parametreleri böbrek iskemi sonrası böbrek hasarı belirlemek için tavsiye edilir:
   Glomerüler filtrasyon oranı (GFR) değerlendirmek için FITC etiketli inülin klirensi gerçekleştirin. Bir alternatif, kreatinin klirensi ve renal hasar sonrası metabolik kafes soruşturma 24 saat üzerinden serum kreatinin belirlemek. Böbrek H & E boyama ve iskemi sonrası böbrek hasarı ve inflamasyon 24 saat belirlemek için bir miyeloperoksidaz (MPO) ELISA gerçekleştirin.
2. Metabolik kafes soruşturma:
   1. Sol böbrek iskemi sonrası retroperitoneal pozisyona geri döndü ve yukarıda açıklandığı gibi yara kapatılır.
   2. Ameliyat sonunda farelerin 0.3 ml serum fizyolojik IP almak ve bir ısıtma lambası altında 2 saat süreyle kurtarmak.
   3. Daha sonra farelerin metabolik kafesler (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Almanya) 2 kez 24 saat için renal fonksiyonel parametrelerin belirlenmesi için yerleştirilir olacaktır.
   4. Her fare su alımı, 24 saat sonra fare tedarik önce su ile boş ve dolu şişe ağırlığında ve daha tam şişe tekrar tartılarak tespit edilecek. Fare ağırlık olarak iyi bir şekilde belirlenmiş olması gerekir.
   5. 24 saat sonra yaklaşık 75μl kısa isoflorane anestezi altında bir kapiller tüp yoluyla kan, göz arkasında venöz pleksus alınır.
   6. Böbrek fonksiyonu üretici `s protokolü (LT-SYS, İşçi + Technik, Berlin, Almanya) göre, piyasada bulunan bir colorimtric yöntemi kullanılarak böbrek iskemi plazma ve idrar kreatinin 24 saat sonra ölçerek değerlendirilir. Plazma ve idrar konsantrasyonları sırasıyla: Na ^{+, K} + bir alev emisyon fotometre (6361 Elex, Eppendorf AG, Hamburg, Almanya) ile belirlenir . Böbrek boşaltım ve hemodinamik değerler, standart formüller ^{kullanılarak} 15-17 hesaplanır .
3. Renal iskemi sonrası İnülin yükseklik: FITC inülin klirensi deneyler yapılacaktır.
   1. Sürekli i juguler ven kanülenfusion. Bir hazırlık makas (Dumont, TEFE) ven çevresinde iki sütür (4 / 0) ile komşu doku damar diseksiyon sonra. Proximale sütür önce ven kan akışını durdurmak için bir kelepçe yerleştirin. Bundan sonra distal düğüm yakın ve distal sütür biri bir kilo damar gerginlik zorlanma sona erer. Bu damar kateter almak için çok önemlidir. Damar içine küçük bir açıklık kesmek için bir mikro-makas kullanın. Ince bir forseps (Dumont, TEFE) ile açılış tutun ve kateterin damar içine yerleştirin. Kateter kelepçe take off önceden. Tutmadan yerleştirebilirsiniz, böylece kateter herhangi bir gerginlik olduğunu emin olun. Bundan sonra ikinci proksimal dikiş ven ve kateter üzerinden kapatın.
   2. Zamanlı idrar toplama için mesaneye bir kateter yerleştirilir. Bu nedenle mesane deri üzerinde kısa bir kesi kesti. Mesane, cilt deliğinden dikkatlice çıkarın. Mesane ıslak bir mendil ile sabitleyin. Mesane (4 / 0) üzerinden hazırlanmış bir dikiş yerleştirin.
   3. Kolay mesane düzeltmek için kateter etrafında bir halka almak için kısa bir ucunda bir kateter parçası (1.5cm) ve ısı kesin.
   4. Mesane içine en üst kısmında bir delik kesin. Kanamayı önlemek için damarlar arasındaki kesim olun. Kateter mesane içine büyük ucunu ve kateter ve mesane üzerinde dikiş yakın.
   5. Tüm farelerin vücut ağırlığının% 20 eşit bir miktarı% 0.85 sodyum klorür solüsyonu bolus alırsınız. Sürekli infüzyon, vücut ağırlığı 800ul/h/25g ve FITC inulin tüm böbrek glomerüler filtrasyon oranı (GFR) değerlendirilmesi için infüzyon eklenir bir oranda korunur. , 20 dakika hayvanların stabilizasyonu sonra, 20 dakika zamanlı idrar, idrar akım hızı ve FITC inulin belirlenmesi için yapılır (dört kez). Kan FITC inulin ölçümü için her dönem ortasında elde edilir.
   6. 20 dakika, toplama süreleri bir zamanlayıcı kullanın başlarken. Mesane kateteri sonuna küçük bir Eppendorf tüp içine yerleştirerek idrar toplayın. Idrar miktarını belirlemek, böylece idrar toplama öncesi ve sonrasında tüp ağırlığı ölçün. Kan örnekleri her toplama döneminin ortasında kılcal tüpler aracılığıyla retroorbital kan toplama formu venöz pleksus yoluyla alınır.
4. Kan ve böbrek daha fazla analiz, örneğin MPO ELISA, sitokin EISA, histoloji için her işlemden sonra toplanabilir.

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 iskemi asılı ağırlık sistemi Model: asılı bir ağırlık sistemi sol böbrek renal iskemi ikna etmek için kurulmuştur . Bu nedenle, 8.0 naylon dikiş renal arter altına yerleştirilen ve her dikiş sonunda küçük bir ağırlığı (1g) bağlıydı. Bu deney tasarımı, uygulanması ve serbest ağırlık yükünü reversibl renal arter oklüzyonu sağlar.

Tartışmalar

Özetle, bu çalışmada, renal iskemi, renal arter oklüzyonu asılı ağırlık sistemi kullanarak bir fare modeli gerçekleştirmek için yeni bir teknik açıklar. Aslında, bu çalışmada, böylece renal pedikül sıkma ile ilişkili değişkenliği en aza indirmek, yüksek tekrarlanabilir yaralanma göstermektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pentobarbital Sodyum	Vortech İlaç Ls, Ltd	VPL 9372	Içinde 4mg/mL serum fizyolojik
Dikiş, ipek 4.0	Harvard Apparatus	517698
Dikiş, Prolen 8.0	Ethicon, ABD	M8739	yeniden kullanılabilir
diseksiyon mikroskobu	Leica	n / a	geniş çalışma mesafesi düşünün
Isıtma Tablo	Rt, Effenberger, Almanya	n / a	sadece ve tek bir sağlayıcı
Cerrahi aletler	TEFE, Dumont		ince bir mikrodamar makas