İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Özet

Dendritik hücreler alımı antijenler ve T hücrelerine işlenir antijenleri bağışıklık organları doğru göç. Qdot nanokristal etiketleme, uzun ömürlü ve istikrarlı bir floresan sinyali sağlar. Bu floresan mikroskobu ile farklı organlara dendritik hücreler izleme sağlar.

Özet

Dendritik hücreler (DC), periferik dokularda ve immünolojik, timus, kemik iliği, dalak, lenf düğümleri ve Peyer ^Kullanıcı yamaları 1-3 gibi organlarda bulunan profesyonel antijen sunan hücreler (APC ). DC'ler onlar, süreç ve major histokompatibilite moleküller (MHC) bağlamında kendi yüzeyinde bulunan antijenlerin varlığı, periferik dokularda örnek organizma mevcut. Sonra, antijen yüklü DC'ler T lenfositlerin spesifik immün yanıtları tetikleyen işlenmiş antijenini immünolojik organlara göç ederler. DC'ler göçmen yeteneklerini değerlendirmek için bir yolu, onları floresan ^boyalar 4 etiket .

Bu vesile ile biz fare kemik iliği kaynaklı DC etiket Qdot floresan nanokristaller kullanımını göstermek. Bu etiketleme avantajı Qdot nanokristaller kurtarılan dokularda etiketli hücreleri tespit için ideal istikrarlı ve uzun ömürlü floresan sahip olmasıdır. Bunu başarmak için, ilk hücre DC farklılaşma ikna etmek için fare kemik ilikleri kurtarıldı ve granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör varlığında 8 gün kültüre olacaktır. Bu hücreler daha sonra in vitro inkübasyon kısa floresan Qdots ile etiketlenir. Boyanan hücrelerin floresan mikroskobu ile görüntülenebilir. Hücreler noktada deney hayvanlarının içine enjekte edilebilir ya da inflamatuar uyaranlara ile in vitro inkübasyon üzerine olgun hücrelerin içine olabilir Bizim ellerde, DC olgunlaşma floresan sinyal kaybı tespit etmedi ne Qdot boyama DC'ler biyolojik özellikleri etkilemez. Enjeksiyon üzerine, bu hücrelerin tipik diseksiyon ve tespit işlemleri aşağıdaki floresan mikroskobu ile bağışıklık organlarda tespit edilebilir.

Protokol

1. Fare femur ve kemik iliği hücrelerinin süresince tibialar ve kültür diseksiyonu

1. CO ₂ boğulma 2 fareler Kurban ve dikkatli bir şekilde kemik uçları kesmeden tibiaları ve femur teşrih.
2. Kağıt mendil kullanarak, bağlı tüm dokulardan kemikleri temizleyin. Kemikleri kırmak için değil dikkatli olun.
3. 35 mm Petri kabında 10 dakika boyunca% 70 etanol daldırma kemikleri sterilize edin. Bu andan itibaren, hücre kültürleri kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kaput içinde çalışır.
4. Etanol kemikleri kurtarma ve biyogüvenlik kabini içinde bir Petri kabındaki 5 dakika boyunca onları hava kurumaya bırakın.
5. En ince ucu yarısında femur ve tibia kesin. Steril bir Petri kabı steril bir şırınga kullanarak RPMI orta 1 ml (serum olmadan ancak antibiyotiklerle) ile kemik içinde infüze.
6. Hücre süspansiyonu sallanan bir kova rotor ile soğutmalı santrifüj 1100 RPM (4 ° C) 15 ml santrifüj tüpüne 10 dakika santrifüj RPMI ortamda toplanan ve 2X yıkanır.
7. Son yıkamadan sonra, ACK lizis tamponu 2 ml hücrelerin tekrar süspansiyon ve kırmızı kan hücreleri ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
8. % 10 FBS RPMI 13 ml ekleyin, tekrar süspansiyon ve 1.6 'da açıklandığı gibi aynı ayarları ile bu ortamda 2X yıkayın.
9. 2 ayarlamak, hücre sayımı RPMI% 10 FBS ve eklemek rm-GM-CSF (20 ng / ml son konsantrasyon) ⁵ x 10 ⁵ hücre / ml.
10. CO ₂ inkübatör (37 ° C,% 5 CO _2), steril, mikrobiyolojik kalite, 10 cm Petri kabı ve kültür için 10 ml süspansiyon ekleyin .
11. Üç gün sonra, hazırlanan plakaların her biri için 20 ng / l ile rmGM-CSF RPMI% 10 FBS başka bir 10 ml ekleyin.
12. Üç gün sonra 10 ml hücre süspansiyonu, her Petri kabı kurtarıldı 1.6 olarak santrifüj, rmGM-CSF RPMI% 10 FBS aynı hacimde yeniden süspanse ve Petri kabı geri döndü. Hücreler, _CO 2 inkübatör 2 ek gün boyunca kültür .

2. DC'ler Toplama ve etiketlenmesi

1. 8 gün sonra kültür gevşek yapışık hücrelere taze orta Petri kapları yıkanarak kurtarıldı. Bu protokol elimizde 2-4 x10 yaklaşık ⁸ DC'ler vermektedir. Hücreler flow sitometri DC fenotip için analiz edilebilir.
2. Toplanan hücreler daha sonra üreticinin talimatlarına sıkı sıkıya takip Qtracker 655 Hücre Etiketleme Kiti ile etiketlenir.
3. Biz 10 nM konsantrasyonda Qdots fare kemik iliği kökenli DH'leridir etiketleme mükemmel sonuçlar aldı. Bunu başarmak için, aynı hacimde Qtracker Hücre Etiketleme Kit bileşenleri A ve B, eşit hacimlerde karıştırıldığında, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ve hemen 30 saniye vorteks taze orta 1 / 100 sulandırılmış.
4. 5 x 10 ⁶ DC'ler leke için, her kiti bileşenleri Eppendorf tüp ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe A ve B 5 ul karıştırın. Daha sonra, 1 ml RPMI% 10 FBS inkübe ve 30 saniye için vorteks ekleyin.
5. Içeren hücre süspansiyonu 5 x10 ⁶ DC'ler 0,5 ml ekleyin ve 37 inkübe ° C, 60 dk .
6. Daha sonra, RPMI% 10 FBS (1,100 RPM) 2X hücreleri yıkayın. Hücreler, deneysel fareler enjeksiyon için daha fazla kültür veya RPMI PBS içinde yeniden süspanse edilebilir.

3. Etiketli DC Değerlendirilmesi

1. Hücre etiketleme floresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bunu başarmak için, hücre süspansiyonu bir damla (Şekil 3, bir mikroskop lamı eklenir, bir cam lamel ile kaplı ve floresan mikroskobu bu Qdots sırasıyla 565nm ve 405-525nm emisyon ve eksitasyon spektrumları olduğunu dikkate alarak ile değerlendirildi. )
2. Bu noktada, hayvanlar etiketli hücreler enjekte etmek için kullanılacak, ya da olgunlaşma bu hücrelerin 48 saat süreyle inkübe edilmesiyle tetiklenen olabilir (37 ° C, 5 CO ₂₎ (100 ng / ml) ve TNF-(LPS varlığında 20 ng / ml). Floresan etiketleme DC olgunlaşma (Şekil 4) tarafından etkilenmez.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu vesile ile biz fare kemik iliği kökenli DH'leridir hazırlamak için nasıl tanımladı ve bunların nasıl floresan Qdots etiketli Şekil. Şekil 1, hücre elde etmek için yordamı özetlemektedir. 2 Qdots onları etiket prosedürü gösteriyor. Şekil. 3, neredeyse tüm hücreleri bu yordamı ile etiketlenir ve bu inflamatuar faktörlerin DC olgunlaşma (Şekil 4). Şekil etkilenmez. 5 inflamatuar bir kokteyl ile tedavi edildiklerinde Qdot lekeli DC'ler (Fig.5a) lekeli olmayan hücrelere benzer davrandığını göstermektedir. Her iki hücre hazırlıkları kostimülatör moleküllerin benzer şekilde ifade upregüle (Şekil 5b); ve olgunlaşması uyaranlara üzerine IL-6 (Şekil 5c) ve nitrik oksit (Şekil 5d) benzer miktarlarda üretmek. Önceki teknolojik sıçramalarda ile aynı fikirdebu Qdot boyanma gösteren lı yayınlanan verilerin, immün yanıtları [6] eliciting yetenekli olgun hücrelere dönüşme yeteneği DC etkilemez. Bu hücreler daha sonra enjekte eden deney hayvanları için de kullanılabilir. Şekil. 6, farelere etiketli DC'ler intravenöz enjeksiyon 2 gün sonra, biz, dalak Qdot lekeli hücreleri algılamak için başardık . Bu aynı zamanda, in vivo olarak DC göç değerlendirmek için Qdot nanokristallerin kullanımını gösteren yayınlanmış daha önceki veri ile anlaşma [6], non-invaziv görüntüleme ve akım sitometri.

Şekil 1 kemik iliğinden DC nesil akış şeması. Bu vesile ile biz, kemik iliğinden elde edilen DC elde süreci betimliyor. Tibiaları ve femur disseke ve doku çevresindeki temiz. Kemik ipuçları korunur ve kemiklerin iç vasatı ile yıka. , Kırmızı kan hücreleri ortadan kaldırarak sonra, kemik iliği hücreleri DC'ler onları ayırt etmek için, GM-CSF huzurunda 8 gün boyunca kültür.

Şekil 2 etiketleme prosedürü akış şeması. Eşit alikotları Qtracker Hücre Etiketleme Kit bileşenleri A ve B Eppendorf tüp içinde karıştırılır. Dendritik hücreler, GM-CSF ile 8-gün kemik iliği kültürleri toplanan ve 37 ° C'de 60 dakika etiketleme boya ile karıştırılır. Sonra hücrelerin aşırı etiketleme partikülleri ortadan kaldırmak için medya yıkanır.

Şekil 3 etiketleme hemen sonra DC'ler Floresan microphotography. Etiketli hücreleri bir damla, bir cam slayt üzerine yatırılır ve bir lamel ile kaplıydı. Sonra floresan mikroskop, örnekler incelendi ve görüntüleri Micropublisher 5.0 Dijital CCD Renkli Kamera (Qimaging, Surrey, BC Kanada) yoluyla elde edildi.

Şekil 4 DC'ler in vitro olarak 48 saat olgunlaşma sonra Floresan microphotography. Etiketli DC'ler LPS (100 ng / ml) ve CO ₂ inkübatör (37 ° C,% 5 CO ₂₎ cam slaytlar TNF-α (20 ng / ml) ile 48 saat kültüre edildi. Daha sonra, örnekler, PBS (5 dakika, 2X) ile yıkanır aseton (15 dk, 4 ° C) ile sabit ve DAPI ile zıt. Hücreler, yukarıdaki gibi bir floresan mikroskop değerlendirildi.

Şekil 5 Qdot lekeli olgun DC'ler Biyolojik aktivite. Yukarıdaki gibi in vitro olgunlaştı Etiketli DC'ler flow sitometri analiz (A) ve (B). (A) Qdot boyanan hücrelerin FL3 (PercP) kanal güçlü bir sinyal verir. Gölgeli histogram: lekesiz kontrolü. Ve izotip kontrolleri, (B) Qdot lekeli ve lekesiz DC'ler ayrıca CD86 ve CD40 olgunlaşma belirteçlerinin karşı spesifik antikorlar ile boyandı. Hücreler daha sonra bir FACSort akış sitometresi (Becton Dickinson, San Jose, CA) incelendi. Ayrıca, IL-6 (C) ve nitrik oksit (NO), olgun Qdot lekeli DC'ler ve kontrollerin Süpernatantları tespit edildi. IL-6 ve nitrik oksit düzeyleri, ELISA analizi ve daha ^önce 7 açıklandığı gibi Griess ^tahlil, 8 sayesinde tespit edildi . Bu rakam gösterdi tüm veriler benzer sonuçlar gösteren iki ya da üç bağımsız deneyler temsilcisidir. Veri GraphPad yazılımı kullanılarak ANOVA ile analiz edildi.

Şekil 6 disseke dokularda etiketli DC'ler tespiti. Etiketli olgun DC'ler (1x10 ⁶ hücre) intravenöz C57BL / 6 farelere enjekte edildi. (A) İki gün sonra fareler sakrifiye edildi ve toplanan dalak, dondurulmuş ek bileşenini, OCT gömülü ve 8 mcM bölümden bir Kriyostat kullanılarak hazırlanmıştır. Daha sonra, numunelerin aseton (15 dk, 4 ° C) sabit ve DAPI ile zıt. Hücreler yukarıdaki gibi bir floresan mikroskopta incelendi Şekil 6a: 40X büyütme, Şekil 6b: 100X büyütme, Şekil. 6C, 400X büyütme.

Tartışmalar

T hücre etkileşimleri veya DC gelişimi ve çeşitli hastalıklar ^9-11 rollerini belirlemek: DC araştırmak; murin miyeloid) DC'ler yoğun DC-temelli aşıların etkinliği ve iyileştirme belirlemek amacıyla kullanılan edilmiştir. Bu vesile ile biz tibiaları ve femur kemik ilikleri kurtarıldı öncülerden DC'ler oluşturmak nasıl göstermektedir. Biz, etanol 70% boğulma yolu ile bize bunları sterilize etmek için izin verir, böylece kontaminasyon olasılığını azaltmak ipuçları kesmeden kemikleri kurtarabilirsiniz. DC'ler kemik iliği hücreleri ayırt etmek için sadece ⁵ Daha önce açıklandığı gibi GM-CSF kullanmak. Bazı protokoller de IL-4 kullanmalarına rağmen, GM-CSF ⁽¹²⁾ yüksek düzeyde çalışırken bu sitokin gerekli olmadığı bildirilmiştir. Gerçekten de, daha önce bu DC'ler bağışıklık yanıtlarını ¹³ ikna etmek mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bakım, bağlı hücreleri daha monosit gibi fenotip beri 8-günlük kültürlerden gelen orta ile Petri bulaşık sadece gevşek yapışık hücrelere kurtarmak için alınması gereken vardır. Burada DC'ler floresan Qdot parçacıklar ile etiketleme göstermektedir. Bu etiketleme, diğer yöntemler açısından bazı avantajları vardır. İlk olarak, Qdots parçacıkları kolayca hücre içine dahil edilmiştir. İkincisi, floresan sinyal çok yüksek ve DC olgunlaşma değişmez. Üçüncü olarak, doku veya hücrelerin, aseton gibi çözücüler, GFP boyama protokolleri seçmek için şu anda daha fazla esneklik vererek, ^DC'ler 14 etiketlemek için kullanılır ise ne olur aykırı ile sabit floresan kayıp değil . Son olarak, bu parçacıklar tarafından verilen yüksek floresan sinyal hücrelerin doku otomatik floresan rağmen görselleştirme sağlar. Daha önce ⁶ açıklandığı gibi, Qdot boyama, bu hücrelerin olgunlaşma yeteneği etkilemedi . Bu vesile ile biz Qdot-lekeli DC'ler kostimülatör molekülleri upregulating ve inflamatuar uyaranlara yanıt olarak IL-6 ve nitrik oksit üreten, lekeli olmayan DC'ler benzer bir şekilde davrandığını göstermektedir. DC'ler bağışıklık tepkileri tetikleyen uzmanlaşmış hücreler olsalar da, kanser ve ateroskleroz ^{4, 15, 16} gibi patolojik durumların katılmak gösterilmiştir. Onlar da hatta yeni gemiler ^{19, 20} gelişmekte katılan yapısal olarak önerilen anjiyogenik süreci ^{17, 18,} ​​katılmak için öne sürülmektedir. Böylece, DC in vivo izleme ve dokuların farklı ^{4, ​​21} coğrafi lokalizasyon belirlenmesi için izin ^{yöntemleri, 22} çok değerlidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
C57BL / 6 farelerinde	Jackson laboratuvarlar		Kadın, eski 6-8 hafta
RPMI	Invitrogen	11875-119
Fetal sığır serumu, nitelikli	Invitrogen	10437-028
Antibiyotik-antimikotik	Invitrogen	15240-096
PBS	Invitrogen	10010-049
ACK Parçalama Tampon	Lonza Walkersville, Inc.	10-548E
GM-CSF Rekombinant fare	PeproTech Inc.	315-03
Qtracker 655 Hücre Etiketleme Kiti	Invitrogen	Q25021MP
Lipopolisakkaritlerinin	Invivogen	tlrl-eblps
Rekombinant fare TNF alfa	Peprotech	315-01A
CD86 antikor	BD Biosciences	553691
CD40 antikor	BD Biosciences	553791
Griess reaktif sistemi	Promega	G2930
IL-6 yakalama antikor	eBioscience	13-7061-81
IL-6 algılama antikor	eBioscience	13-7062-81