Kuş FTA Kartları İnfluenza Sürveyans: Alan Yöntemleri, Biyogüvenlik ve Ulaşım Sorunları çözüldü

Özet

Kuş Gribi Virüsler RNA, korumak, tespit ve sıra için bir yöntem doğrulanmış ve kuşların doğal dışkı örnekleri kullanarak uzatıldı. Bu teknik, bir soğuk zincir ve bulaşıcı virüslerin taşıma sürdürmenin gerekliliğini ortadan kaldırır ve 96-iyi bir yüksek verimli kurulum yapılabilir.

Özet

Kuş Gribi Virüsler (AIVs) insanlarda ¹ de dahil olmak üzere birçok memeli, bozar. Bu AIVs neredeyse tüm olası virüs alt tipi ² barındıran, kendi doğal hosts çeşitlidir. İnsan gribi pandemiler başlangıçta AIVs ³ kaynaklanmaktadır. Birçok ölümcül H5N1 salgınları sırasında, son yıllarda insan vakaları bildirilmiştir. Son zamanlarda yeni bir AIV ilgili gerginlik, insan nüfusunun kasıp kavuran 'domuz gribi salgını' ⁴ neden. Insan ticareti ve ulaşım faaliyetleri yüksek derecede patojen suşları ⁵ yayılması için sorumlu olacak gibi görünse de, dağılma da kısmen yabani kuşlar ^{6, 7} atfedilen olabilir. Ancak, tüm AIV suşları gerçek rezervuarı yabani kuşlar.

Bu ve kanatlı sektöründe ağır ticari kayıplar karşısında tepki olarak, büyük gözetim programları AIVs ekolojisi hakkında bilgi toplamak için ve bazı yüksek derecede patojen suşları ^8-12 algılamak için erken uyarı sistemleri kurmak için küresel uygulanmıştır. Geleneksel virolojik yöntemlerle virüs sağlam ve analizden önce ekili gerektirir. Bu, derin dondurucu ve taşıma sırasında yerde olmak ağır biyogüvenlik prosedürleri ile sıkı soğuk zincirleri gerektirir. Bu nedenle, uzun vadeli bir gözetim, genellikle iyi donanımlı laboratuvarlara yakın birkaç alan istasyonları sınırlıdır. Lojistik hantal prosedürler uygulanmaktadır sürece uzak bölgelerde örneklenmiş olamaz. Bu sorunlar ^{13 tanınan, 14} ve alternatif depolama ve taşıma stratejileri (alkol veya guanidin) ^15-17 araştırıldı edilmiştir. Son zamanlarda, Kraus ve ark. ^18, özel bir filtre kağıdı dayalı toplamak için bir yöntem, saklama ve taşıma AIV örnekleri, tanıttı . STA kartları ¹⁹ kuru bir depolama temeli ²⁰ RNA korumak ve iletişim ²¹ üzerine etkin patojenlerin kılmak. Bu çalışmada, STA kartları ters transkripsiyon PCR ve ortaya çıkan cDNA dizisi ve virüs genleri ve kararlı olabilir AIV RNA tespit etmek için kullanılabileceğini gösterdi.

AIV kullanılmış ve örnekleri ayrı ayrı ele alındı ​​Kraus ve ^ark. 18 çalışmasında bir laboratuvarda izole . Burada sunulan uzantısı, Ottenby Kuş Gözlemevi (SE İsveç) ördek tuzağı yabani kuşların dışkı örnekleri saha şartlarında yöntemlerinin yararlılığı göstermek için doğrudan test edildi. Kloakal bezlerden ördek ve örnek toplama yakalamak olduğunu göstermiştir. Geçerli protokol, tek tüp işleme 96-iyi bir tasarım iş akış yukarı ölçeklendirme içerir. FTA kartları yöntemi geleneksel yöntemlere göre daha az duyarlı olmasına rağmen, büyük gözetim programları için mükemmel bir ek sağlar. Korunması için soğuk zincir veya alkol ya da guanidin olarak tehlikeli reaktifler, nakliye açısından bir güvenlik düzenlemelerine gerek kalmadan dünyanın herhangi bir yerinden gelen örneklerin toplanması ve analizi sağlar.

Protokol

1. Ördek Yakalama ve kloakal Swab

1. Tuzak cazibesi ördek veya gıda ile çekerek bir kafes cinsi Enes (ya da diğer kuşlar) ördekler dabbling ve bireysel karton kutular içine koydu. Ulaştırma kutusu zamanı yakalamak için kısa bir mesafe içinde bir alan istasyonu kurarak, örneğin, minimum düzeyde tutulmalıdır. Lojistik durumlarda her çalışma değişebilir. Tavsiye ve her yeni set-up için ilgili hayvan etik kurul onayı aranmalıdır gerekiyor. Alternatif olarak, avcı vurdu kuşlar da tadılabilir.
2. Kanatlarını onun vücut için sıkı tutarak kutunun ördek dışarı atın. Örnek taze bırakarak, doğrudan kutunun altındaki olguların çoğunda mevcut olacaktır. Steril bir çubukla Pick up ve whatman FTA kartı sıvı uygulamak. Aksi takdirde, kloakal sürüntü gerçekleştirin.
3. Sırtında ördek açın. Bu lağım ve örnekleme erişime izin kolaylaştırır. Lağım kuyruk tabanına yakın karın altında yer çıkıntılı bir yapı. Deneyimli bir kişi kuş tutun ve örnek aynı zamanda, ya da başka bir ikinci kişi yardımcı olabilir.
4. Dikkatlice yerleştirin ve steril plastik rayon çubukla (Copan, İtalya), yaklaşık 1 cm lağım nazik bir girdap yapmak. Whatman FTA kartı yüzey üzerinde lağım sıvıları ile çubukla döndürün. Hayvan örnekleme yapıldıktan sonra derhal serbest bırakılmasını arzu edilir.
5. En az 1 saat oda sıcaklığında FTA kartları Kuru, daha sonra kağıt torba (örneğin zarf) Her bir numune ayrı ayrı saklayın. Depolama muhtemelen nemli iklimlerde silika boncuk, oda sıcaklığında mümkündür. Gönderme ve kurumların biyogüvenlik memurları alan patojenler FTA kart yüzeyi ile temas halinde aktif hale gelir bu yana, normal posta yoluyla FTA kartları göndermek için izin verebilir.

2. Viral RNA İzolasyonu

1. Dışkı / kloakal sıvı da dahil olmak üzere STA kartı malzeme ayıklayın. Punch üç Harris 2 mm zımba ve yeri bir RNaz ücretsiz 96well plaka bir kuyuya bu diskler. Her yeni örnek arasında, alkol ve Kim hassasiyet (Kimtech) silin zımba dikkatle temizleyin. Her zaman pozitif ve negatif denetimlerini kullanın. Pozitif kontrol taze bir STA kartına uygulanan bir laboratuvar suşu, ya da olumlu bir sonuç biliyorum doğal bir örnek oluşabilir. Negatif kontrol olarak, boş bir STA kart diskleri yumruk. Ayrıca, (şablon olarak su ile) daha sonra deney PCR kontrolü için başka bir de serbest bırakın.
2. 70μl RNA ekstraksiyon hızlı çözüm (Ambion) ve ısı-mühür plaka (AbGene Thermo-Sealer) ekleyin. , (Önceden test kullanılan plaka çalkalayıcı modele bağlıdır) taşma neden olmaz belirlenen hız ile bir tabak çalkalayıcı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. MagMAX-96 viral RNA izolasyon kiti (Ambion) ile üreticinin protokollere göre viral RNA izolasyonu taşıyın. Kısaca: Ekle 130μl hazırlanan lizis / her bir kuyu için bağlayıcı bir çözüm (kit). Transferi 50μl her iyi FTA kartı malzemesi ayıklanır. 1 dakika için plaka çalkalayınız.
4. 20μl hazırlanan boncuk karışımı (kit) yukarı ve aşağı pipetleme tarafından her bir örnek ve karışımı ekleyin. 5 dakika için belirlenen hız çalkalayınız. RNA molekülleri, manyetik boncuk bağlanacaktır.
5. Bir manyetik plaka Taşı 96-boncuk yakalamak stand. Kullanılan manyetik stand modeline bağlı olarak, bu 5 dakikadan daha fazla sürebilir. Çözümün tamamen açık haline geldiğinde, kaldırmak ve süpernatantı atın. Sonra manyetik stand plaka kaldırmak.
6. Boncuklar, yıkama solüsyonu 1 ile iki kez yıkama solüsyonu 2 (kit) ile iki kez yıkayın. 4 yıkama adımları her örnek 150μl hazırlanan yıkama solüsyonu için (ya da çözüm tamamen temizlenene kadar) belirlenen hızda 1 dakika, manyetik standı plaka taşımak yaklaşık 5 dakika için boncuk yakalamak sallamak, kaldırmak ve süpernatantı atın. Sonra, manyetik stand plaka kaldırmak sonraki yıkama solüsyonu ve yıkama adımları önceden yürütmek. Son yıkama adımdan sonra, plaka çalkalayıcı 2 dakika boyunca oda sıcaklığında ve kuru hava boncuk olduğunca yıkama solüsyonu çıkarın.
7. Boncuk RNA serbest ve plaka çalkalayıcı 4 dakika çalkalanır elüsyon tampon 50μl (kit) ekleyin. Daha önce açıklandığı gibi boncuklar Yakalama. Süpernatant şimdi aşağı uygulamalar için hazırdır izole RNA içerir.

3. AIV Matrix Gene RT-PCR

One-Step Erişim RT-PCR sistemi ile ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) (Promega) 25 ul reaksiyonlarda yürütmek (Kraus ve ark ayarlanabilir ¹⁸ ve ²² Fouchier et al.)

Nükleazlar ücretsiz su	1.5μl
AMV / Tfl5 tampon	5μl
dNTP	0.5μl
astar M52C 22 (10 mcM)	2.5μl
astar M253R 22 (10 mcM)	2.5μl
MgSO 4 (25 mM)	7μl
AMV ters transkriptaz (5u/μl)	0.5μl
TFL polimeraz (5u/μl)	0.5μl
RNA örnek	5μl

Biometra T1 PCR PCR koşulları: 45 az 45 dakika ilk ters transkripsiyon ° C, 2 dakika ilk denatürasyon 94 ° C ve 40 döngü: 94 ° C 1 dakika, 1 dakika boyunca 56 ° C ve 2 dakika süreyle 68 ° C. 68 ek bir 7 dakika uzaması ° C amplifikasyon sonucuna varmaktadır.

4. AI-pozitif Örnekleri Tarama ve Jel Hedeflenen Fragments saflaştırılması

1. 2μl ön eleme için% 1 etidyum bromür (ortalama 2.5μl 100 ml jel) ile boyanmış% 1 agaroz jel (Roche) 2μl 5x yükleme boya (BioRad) ve 6μl su ile karıştırılarak PCR ürün yükleyin.
2. DNA boyutu standart (BioRad EZ yük 100 baz puan (bp) merdiven) ile birlikte, 120V az 1 saat için jel çalıştırın bir jel dokümantasyon sistemi ile görselleştirmek. Şekil 1'de bir örneğe bakın.
3. 2 6μl 5x optik yükleme boya ile bu adayların tüm PCR reaksiyon hacmi (23μl ~ hangi sol) yükleyin beklenen boyut aralığı amplifiye parçaları (200 bp ve 300 bp (hedef parçası 244 bp) arasında örnekleri seçin. % etidyum bromür agaroz jel lekeli ve 2 saat boyunca çalışır.
4. UV-transilluminator'de (Bioblock Bilimsel) jel üzerine yerleştirin ve görsel olarak incelenmelidir. Şekil 2'de bir örneğe bakın. 1,5 ml reaksiyon tüpleri bireysel bir neşter ve yerleştirilen jel doğru boyutu Vergi bantları. Zymoclean Jel DNA Kurtarma Takımı (Zymo Araştırma) ile örneğin, jel parçaları arındırın.

5. Sıralama ve PCR Ürünlerinin Tanıtımı

1. ABI ABI Big Boya 3.1 kimya (Applied Biosystems) ile 3730 kapiller sequencer Sanger sıralama, örneğin hedef parçaları yürütmek. 10-20 ng jel içeren 10μl hacimleri sıralama reaksiyonlar hazırlayın saflaştırılmış şablon cDNA, 1.75μl 5x seyreltme tamponu, 0.5μl Big Boya V3.1 premix, 1 ul ileri astar (M52C ^20, 10 mM) ve ddH2O. Bisiklete binme şartlar şunlardır: 1 dakika 25 devir izledi ilk denatürasyon, 96 de 10 sn ° C - 45 ° C ve 60 az 4 dakika 5 s ° C Arındırmak ve iç protokollere göre sıralama reaksiyon hazırlamak.
2. CDNA dizileri gibi GenBank23 Biyoteknoloji Bilgi (NCBI, Ulusal Merkezi az BLAST gibi web tabanlı araçlar örneğin nükleotid veritabanları, karşı çıkan http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi tanımlayın ).

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Yeşilbaş (Anas platyrhynchos) Ottenby Kuş Gözlemevi Aralık 2007'de örneklendi. Bu protokol açıklandığı gibi, her yeşilbaş itibaren FTA kartta bir örnek alınmıştır. FTA kartları nakliye sonra, iki yıl boyunca -20 ° C'de derin dondurucuda muhafaza edildi. Laboratuvar aynı FTA kartı örneği Kraus ve ark test izole ^18, pozitif kontrol yanı sıra dokuz on kat seri dilüsyonları olarak dahil oldu . İki negatif kontroller) boş bir STA kart çıkarma, carry-over-zımba olup olmadığını sınamak için, ii) nükleaz ücretsiz su şablon olarak kullanılmış olan RT-PCR reaksiyonu kirlenme meydana gelirse test etmek için, ya da i PCR reaksiyonu hazırlanması.

84 numuneler analiz edildi. Bu 84 örneklerden PCR ürünlerinin jel resmi Şekil 1'de bulunabilir. Doğal örneklerinden belirsiz gruplarından çok sayıda dışkı çeşitli mikrobiyal kontaminasyon varlığı nedeniyle görülebilir. Ancak, primer çifti hedef parçası 244 bp uzunluğunda. Jel (Şekil 1), yaklaşık olarak doğru boyut aralığı (200 bp ve 300 bp arasında) parçaları üretilen örneklerin bir alt kümesi tüm PCR reaksiyon hacmi yüklendi. Ek Şekil 1 jel kesilen bantların hangi bir örnek bulunabilir. Pozitif kontrol ek olarak, bu örnekler iki yeni protokol (69.899 ve 69.912) pozitif bulunmuştur. NCBI nükleotid veritabanına karşı BLAST arama, tüm diğer bantlar bakteriyel dizileri en yakın benziyordu veya okunabilir bir dizi hiç verim vermedi AI matris gen (Şekil 3) olarak kendi kimliklerini ortaya çıkardı.

Şekil 1. PCR ürünleri bir ön tarama Jel resim pozitif kontrol 2 ul PCR ürünü, sPozitif kontrol, iki negatif kontroller ve 84 kloakal örnekleri erial dilüsyonları yüklendi. 48 örnekleri alt panelinde üst jel paneli ve 48 örnekleri gösterilmiştir. Kırmızı oklar, 100 bp DNA büyüklükleri standart için kullanılan jel şeritleri göstermektedir. Resimde, kırmızı daireler beklenen boyut aralığı bantları göstermektedir. Mavi çevreler belirsiz bir Amplikon (sol üstte) veya boyutu 100 bp (sağ altta) altına astar dimer artefact göstermektedir.

Şekil 2. 200 bp ve 300 bp (hedef parçası 244 bp) arasındaki bantları ile örneklerin parçaları ile doğru boyut aralığı seçimi. Örnekleri seçilmiştir. Yeşil ok pozitif kontrol gösterir, iki kırmızı oklar NCBI nükleotid veritabanı cDNA dizileri karşılaştırarak AIV pozitif olarak teyit edildi örnekleri göstermektedir.

Şekil 3. NCBI bir temsilci BLAST arama Ekran yakalama eksize parçaları elde edilen cDNA dizileri biri NCBI web sitesinde nükleotid veritabanına karşı sorgulanır oldu. Örnek doğru AI Matrix gen parçası olarak tanımlanır. Bu görüntünün tam boyutlu bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.

Ek Şekil S1. Seçilen örneklerin jel eksize Gruplar Bu resim, 200 bp ve 300 bp arasında aday bantları sonra Şekil 1'de tasvir jel alınmıştır kesilmiştir .

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol AIV varlığı dışkı ya da benzer örnekleri ekrana ek bir yöntem sağlar. Özellikle örnek toplama, hızlı ve kolay hale getirmek için tasarlanmış. Bu sayede daha az eğitimli kişiler, avcılar ya da yaban hayatı yöneticileri olarak AI gözetim katkıda bulunmak için yapar. Mümkünse örnekleri dondurma önerilmez rağmen, soğuk zincir, uygulanması gerekir. Örneğin oda sıcaklığında bir kaç gün, laboratuvar taşıma sırasında kartları kuru kaldığı sürece, RNA molekülleri FTA kartları için bir sorun değildi. Araştırma topluluğu tarafından değerlendirilir, alkol ¹⁵ veya guanidin ¹⁶ gibi diğer non-soğutmalı depolama sistemleri, tehlikeli doğası nedeniyle özel nakliye düzenlemeleri gerektirir. Buna karşın, STA kartı yöntemi tehlikeli maddelerin nakliye gerektirmez. Ancak, bu konuda bir başka ilginç depolama ortamı, ¹⁷ ya tehlikeli değildir RNAlater ™. Örnek herhangi bir standart moleküler laboratuvarda analiz yapılabilir. Her zamanki PCR reaksiyonları ve kılcal dizilimini dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Örnek toplama zaten potansiyel patojen ajanları FTA kartı antibakteriyel ve antiviral aktivite inaktive edildi çünkü tüm adımlar bir biyogüvenlik düzeyi olmadan yerine getirilebilir.

Çapraz kontaminasyon ve yabani kuş örnekleri ile sonraki yanlış pozitif örnekler çalışmalarda gözlenmemiştir. Ancak, RNA ve PCR ile çalışırken, pre-ve post-PCR adımlar için çalışma yerleri ve ayrı odalarda temizlemek için özel dikkat etmek her zaman tavsiye edilir. Davlumbaz Çalışma laboratuarda aerosol kontaminasyon riskini azaltır. Pipetleme filtre ipuçları ile yapılmalıdır.

84 örnek altı geleneksel RealTime RT-PCR yöntemi ²⁴ ve RealTime RT-PCR Ct değerlerini bilinen olumlu olduğunu biliyorum aynı ördek aynı anda alınan numuneler üzerinde önceki bir çalışmada. Ct değerleri <30 (viral RNA yüksek konsantrasyonda belirten) ördekler yöntem kök tarafından tespit edilen iki pozitif örnekler. Geleneksel protokol ile pozitif bulunmuştur diğer dört örnek Ct değerlerinin> 30 (daha az yoğun) ve protokol tarafından tespit edilemedi.

Sadece nispeten yüksek virüs titreleri olan örnekleri bizim testinin pozitif olduğunu ve bu yöntemin duyarlılığı tüm pozitif örnekleri tespit edilememesi kaynağı olması muhtemeldir. Ayrıca, bu çalışmada örneklem büyüklüğü çok düşük olduğunu ve daha kontrollü ve titiz deneyler yapılır eğer bu yöntem tamamen geliştirilmiş ve değerlendirilmelidir. Ancak, bu örnekleri uzak bir alana toplanan olurdu, geleneksel analiz hiç mümkün olmuş olmaz. Ayrıca, bu ilk sonuçlar, daha fazla optimizasyon ihtiyacı pilot deneyler kaynaklanmaktadır. Örnek toplandıktan sonra düzenli olarak -20 ° C derin dondurucu, iki yıllık depolama bir dönem muhtemelen viral RNA kalitesini etkiledi. Bu mümkün RNA bozulması inaktive virüs oda sıcaklığında depolama ile ilgili önemli bir konudur. Alternatif sıvı, yukarıda da belirtildiği gibi saklanan örnekler, ^viral genom 16 uzamaktadır analizi etkileri önemli ölçüde bozulma muzdarip. Çalışmamızda test olmamakla birlikte, FTA kartları Avian İnfluenza virüsleri ^{25, 26} çok benzer diğer RNA sistemlerinde sağlam RNA molekülleri korumak için uygun olduğu kanıtlanmıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif ya da enstrüman Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Plastik rayon kuru çubukla	Copan, İtalya	167KS01
STA kartı	Whatman		çeşitli seçenekler
Harris mikro yumruk 2mm mat	Whatman	1154409
RNaz ücretsiz 96well plaka	Greiner Bio-One	652290	veya benzer
Kim hassas mendil	Kimtech	75512
RNA hızlı çıkarma çözüm	Ambion	AM9775
MagMAX-96 viral izolasyon kiti	Ambion	AM1836
Bir Adım Erişim RT-PCR sistemi	Promega	A1250	veya benzer
Agaroz MP	Roche	1388991001	çok amaçlı agaroz
5x yükleme tamponu	BioRad		DNA merdiveni ile teslim
EZ yük 100 bp merdiven	BioRad	170-8353	veya benzer
Etidyum bromür% 1	Fluka	46067	veya benzer
1.5ml reaksiyon tüpleri	Eppendorf		veya benzer
Zymoclean Jel DNA kurtarma kiti	Zymo Araştırma	D4001	veya benzer
ABI büyük boya 3.1 kimya	Applied Biosystems		veya benzer