Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Özet

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Özet

Saccharomyces cerevisiae yaşlanma modeli kullanılarak yapılan çalışmalar, yüksek ^ökaryotlar 1-2 kısmen korunmuş ömrü düzenleyici yollarda ortaya çıkarmıştır . Maya yaşlanma modeli sadeliği ve gücü de, DNA hasarı ve genom bakım yanı sıra, yaşlanma sırasında hastalıkları katkıları çalışma araştırılmalıdır. Burada, maya kronolojik ömrü basit bir DNA ile birleştirerek temel yerine, çerçeve kayması mutasyonları, brüt kromozom düzenlenmeleri ve homeologous / homolog rekombinasyon yanı sıra nükleer DNA onarım faaliyetleri de dahil olmak üzere, yaşa bağlı DNA mutasyonlarının, çalışma sistemi tanımlamak hasar ve mutasyon deneyleri. Burada açıklanan yöntemler genomik istikrarsızlık ve memelilerde yaşa bağımlı DNA mutasyonları ve kanser altında yatan mekanizmaları düzenleyen genleri / yollarının belirlenmesini kolaylaştırmak gerekir.

Protokol

İki ömrü modelleri S. yaşlanma çalışma var cerevisiae: Huzursuz bacak sendromu ve CLS. Replikatif (tomurcuk) ömür (HBS), maya anne hücreleri ^bölümler 3-6 sonlu sayıda geçmesi gözleme dayanır . Biz kronolojik ömrü (CLS), kronolojik yaşam, kültür ya da ^plakaları 7-11 olmayan bölünmesi maya dayalı bir model üzerinde durulacaktır. Wild tip maya sentetik dekstroz tam (SDC) orta 10-12 saat boyunca katlanarak büyür . Glukoz seviyesini düşüren, maya fermantasyonu sonucu solunum anahtarlar, bir süreç diauxic kayması olarak adlandırılır. Hücreler G ₀ tutuklama girmeden önce yaklaşık 48 saat sonrası diauxic aşamasında yavaş bölmek için devam ediyor. Hücrelerin metabolik hızı gün 5-6 (0 gün aşılama gün) kadar yüksek kalır. G ₀ tutuklama ve form zengin YPED plakalar üzerinde koloni çıkabilirsiniz her iki günde bir örneklenmiş kronolojik yaşlanma hücrelerinin yüzdesi, zamanla hücre canlılığı ulaşılabilir.

1. Maya kronolojik ömrü sıvı kültüründe (CLS)

1. 1 ml tam sentetik şekeri orta (SDC, Tablo 1) tek bir koloni İnokülasyon ve 30 (220 rpm) sallayarak gece boyunca inkübe ° C Üç bağımsız koloniler inoculums biyolojik kopyaları sağlamak için her bir suş için hazırlıklı olmalısınız.
2. OD taze SDC orta (genellikle 10 ml) içine bir gecede kültür sulandırınız = 0.05-0.1 (~ 1:100 dilüsyon) ve 30 (220 rpm) sallayarak inkübe ° C Bu zaman noktası, kronolojik yaşlanma gün 0 olarak kabul edilir. Uygun havalandırma sağlamak için bir kültür / balon hacmi (10 ml, 50 ml kültür, ya da daha uzun / geniş deneyler 125 ml 25 ml kültür) 01:05 oranını korumak.
3. 3. gün başlayarak, 2 alikotları şişeden 10 ul kaldırmak, YEPD (% 1 maya özü,% 2 bacto pepton, 2% dekstroz otoklava su, 10 ul seyreltilmiş kültürü (yani, 10 ⁴ -10) 10.000 kez seyreltilmiş % 2 agar) plakaları ve birleştirmek (CFU) oluşturan koloni sayılır önce 48-72 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
4. 3. Gün CFU% 100 hayatta kalma kabul edilir. ~ 20-100 koloniler CFU testi (örneğin, 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10, vb) sağlamak için, sonraki gün yaşlanma kültür Seyreltme faktörü buna göre düzenlenmelidir . DBY746 arka planda vahşi tip hücreler için, CLS, 11 gün% 1 civarına hayatta kalma ulaşır.

In situ canlılığı tayininde Varyasyonları şunlardır :

• Kalori kısıtlaması glikoz sınırlama (CR). Glikoz sınırlı SC orta gecede kültür seyreltilmesi (örneğin, standart% 2 glukoz yerine% 0.5 veya 0.05), genellikle 3. gününde düşük nüfus doygunluk yoğunluğu yol, ancak ^çok ömrü 12 (10% sağkalım), ortalama ve maksimum uzatıldı.
• Aşırı CR / açlık için, (eşit hacimde su tekrar süspansiyon hücreleri ve 3 kez tekrarlayın, 2500 rpm'de 5 dakika boyunca aşağı spin) otoklava su ile günde 3 sabit faz kültürü (genellikle 10 ml olarak yukarıdaki adım 3) yıkayın. Su Incubationof hücreler maya vahşi karşılaşabileceğiniz açlık durumu taklit eder. Her iki günde bir daha sonra yaşlanma kültür otoklava su ile yıkanır ve parçalanmış ölü hücrelerden salınan herhangi bir besin kaldırmak için eşit miktarda su yeniden süspanse edilmelidir. Yukarıda açıklandığı gibi yaşlanma kültürü örneklemesi, canlılığı tahlil gerçekleştirin. Bu açlık durumu vahşi tip DBY746 suşu ¹² ortalama CLS neredeyse iki katına yol açtı.

2. in situ canlılığı tayininde

Sıvı kültüründe, hayatta kalan hücrelerin küçük bir kısmını hücre döngüsü yeniden girdi ve kalan besin ya da orta parçalanan bu ölü hücreleri serbest formu kullanarak büyümek, bir fenotip regrowth olarak adlandırdığı ^/ 13 nefes nefese . DBY746 suşu (trp1) auxotrophy regrowth / nefes nefese sorunu aşmak için kullanır ve aynı zamanda sürekli maruz kalma ya da yoksunluk, çeşitli dış besin veya maya uyaranların etkisi test izin canlılığı-on-a-plate sistem geliştirdi. CLS ^11. Bu aynı zamanda in situ canlılığı tayininde hücreler sürekli ömrü analizi boyunca bol miktarda besin maruz kaldığı bu tür replikatif ömrü modeli taklit eder .

1. 1 ml tam sentetik şekeri orta (SDC) tek bir koloni İnokülasyon ve 30 (220 rpm) sallayarak gece boyunca inkübe ° C En az üç bağımsız koloniler inoculums biyolojik kopyaları sağlamak için her bir suş için hazırlıklı olmalısınız.
2. Kültür ~ 10 ⁸ hücre / ml (OD ₆₀₀ = ~ 10) büyümeye culturewith otoklava su sulandırmak, 100-200 cell/10 ul (genellikle 10 ⁴ kat seyreltme) ve 1.000 cells/10 ul (10 ³ kat dilüsyon).
3. Plaka bir triptofan okulu terk SDC plaka üzerine seyreltilmiş kültür 10-30 ul iki alikot. Içinr ve her bir suş, 8 ila 20 plakaları bir dizi hazırlamak ve kaplama yoğunluğuna göre etiketli (örneğin, 10 ⁴ kat seyreltik, plaka 10 ul veya 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10, 10 ³ -30 , vb), 10-100 koloniler yaşlanma sırasında azalma canlılığı beklentisiyle sayılabilir sağlamak.
4. Plaka ömrü analiz süresi 30 ° C'de inkübe edin.
5. Kaplama yapıldığı gün ve daha sonra her 2 günde bir, bir plaka ve açılan akıllı kaldırmak canlı hücrelerin büyümesine izin 0.5 ml Triptofan (2 mg / ml) ekleyin. Plaka ek 48-72 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Triptofan ek gününde canlılığı için CFU güvenin. Kaplama gününde CFU% 100 hayatta kalma kabul edilir.

In situ canlılığı tayininde Varyasyonları şunlardır :

• Agar plaklarına Yaş hücreleri (aşırı açlık koşul). Ekle 1 ml 2x sonraki gün izin büyüme ve CFU sayısı ¹⁴ yerine triptofan YPED.
• Yaş hücreleri çeşitli karbon kaynakları, örneğin glikoz çeşitli konsantrasyonlarda (glikoz sınırlama kalori kısıtlaması), etanol gibi çeşitli karbon kaynakları, gliserol, asetik asit ¹⁴ triptofan okulu terk sentetik tam orta plakalar. Büyüme ve CFU sayısı izin için 1 ml glukoz / triptofan solüsyonu (% 20 glikoz ve 1mg/ml triptofan) ekleyin.
• Gibi azot gibi diğer besin manipülasyon.

3. Kronolojik yaşlanma sırasında DNA hasarı ve mutasyon sıklığı

Canavanine direnci (Can ^r) ve can1 sıralama
Spontan mutasyon sıklığı, kronolojik yaşlanma kültürlerde canavanine direnci ^{(Can r)} frekans ölçerek değerlendirilir . Plazma arginin permease kodlar CAN1 (YEL063) gen, mutasyonlar, farklı zaman noktalarında toplanan arginin analog ^{L-canavanine.Can} r koloniler karşı dirençli olan hücreler de genomik DNA ve CAN1 sonraki sıralama çıkarılması için kaydedilebilir hale gen mutasyonu spektrum verileri (Mutasyon Surveyor ile SoftGenetics) sağlayabilir.

Temel değiştirmelerin (Trp ⁺ reversions)

Trp1-289 ile Suşlarının TRP1 kodlama sırayla sarı mutasyon (C403T) içerir. Trp ⁺ reversion ¹⁵ trp1-289 frekans ölçümü maya Kronolojik yaşlanma sırasında baz ikame oranı tahmini sağlar.

Çerçeve-kayması mutasyonları

Lys ^- suşu EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200 ura3-52, ade2-1o) LYS2 gen bir BGL II restriksiyon enzimi sitesi oluşturmak için 4 nükleotidler takarak inşa edilmiş bir lys2ΔBgl II mutasyon limanlar . Ekleme / silme küçük mutasyonların ^16-17 ters olabilir lisin için auxotrophy açık okuma çerçevesi sonuçları sonucu 4 vardiya.

Brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs)

Brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) saptamak için, hangi HXT13 (YEL069), son derece gereksiz bir heksoz taşıyıcı kodlama, bir URA3 ^kaset 18 kesintiye uğramıştır, bir mutant suşu oluşturulur. HXT13 CAN1 için telomerik 7.5 kb V. Mutasyonlar kromozom bulunur CAN1 ve URA3 genler hem de sırasıyla, L-canavanine ve 5-fluoroorotic asit (5FOA) hücreleri direnç veren. ^R 5FOA ^r frekans hem genler, analiz meydana gelen nokta mutasyonu düşük frekanslı göz önüne alındığında, hem genlerin kaybına neden GCRs bir tahmin sağlar.

Homolog ve homeologous rekombinasyon

Homolog ters yineler (IRS) (pSR406% 100 ya da taşıma: Kronolojik yaşlanma sırasında homolog seviyesi (% 100) ve homeologous rekombinasyon (% 91) izlemek için, biz lineerleştirilmiş plazmid (intron-IR-URA3 HIS3) mutantlar oluşturulan ) veya IRs homeologous HIS3 lokus ^19% 91 (pSR407). IRs arasında Rekombinasyon fonksiyonel His3 protein ifade sağlar.

1. Normal canlılığı assay (yukarıda açıklandığı gibi) paralel olarak, yaşlanma kültür hücreleri, uygun bir miktarda kaldırmak
   1. Can ^r mutasyon, ~ 2x10 ⁷ hücre (3 gün kültür ul 200) ile başlar;
   2. Trp ⁺ reversion, ~ 10 ⁸ hücreleri (3 gün kültür 500-1000 ul) ile başlar;
   3. Lys ⁺ çerçeve kayması mutasyonu için ~ 10 ⁸ hücreleri (3 gün kültür 500-1000 ul) ile başlar;
   4. GCRs, 2-3x10 ⁸ hücreleri (2-3 ml 3. gün kültür) ile başlamak;
   5. homolog ve homeologous rekombinasyon & tilde ile başlamak5x10 ⁷ hücre (200-500 ul gün 3 kültür);
   kaplama miktarı, toplam canlılığında azalma ve Kronolojik yaşlanma sırasında (Tablo 2) mutasyon sıklığı artış göre ayarlayın . Hypermutator fenotip ile suşların (DNA onarım eksiklikleri olanlar gibi) durumunda, buna göre örnekleme miktarını azaltmak.
2. Pelet tezgah üstü santrifüj makinesi (5 dakika için 6000 rpm) hücreler.
3. 1 ml otoklava su, ve pelet hücrelerin hücre tekrar tekrar
4. Su 100 ul yeniden süspanse hücre pelletini. Plaka hücreler,
   1. arginin-ayrılma sentetik tam orta plakaları ^r mutasyon (SDC-Arg, 60 mikrogram / ​​ml L-canavanine sülfat ile takviye);
   2. Trp ⁺ reversion, triptofan ayrılma plakaları (SDC-Trp);
   3. Lys ⁺ çerçeve kayması mutasyonu, lisin ayrılma plakaları (SDC-Lys);
   4. GCRs, arginin ayrılma plakaları (SDC-Arg) 5FOA (1 mg / ml) ve L-canavanine sülfat (60 mg / ml) ile desteklenmiş;
   5. homolog ve homeologous rekombinasyon, histidin ayrılma plakaları galaktoz (% 2) ile desteklenmiştir.
5. 3-4 gün inkübasyondan sonra CFU Sayısı 30 ° C. Mutasyon frekansı canlı hücrelerin sayısı normalize.

Tamamlayıcı in situ canlılığı tayininde, yaşa bağlı ^Trp + reversion, ^Lys + çerçeve kayması mutasyon, rekombinasyon, ^veya r mi plaka üzerinde yaşlı hücreleri de incelenebilir .

1. Trp, Lys, His-ayrılma ya da L-canavanine sentetik tam orta tabak (yukarıda açıklandığı gibi) Plaka hücreleri (~ 10 ⁸ hücre / plaka).
2. Her iki gün (ya da ilgi bir zaman noktasında), yeni ortaya çıkan koloniler puan.
3. Mutasyon sıklığı, canlı hücreler, belirli bir günde toplam sayısı yeni ortaya çıkan koloniler normalleştirilmesi tahmin edilmektedir.

4. Translesion sentezi (TLS)

Yaşa bağlı mutasyon sıklığı artış, makromolekül hasar, azalmış hücresel koruma / onarım içerir ve yaşlanma sırasında hatalı DNA onarım (Polζ bağımlı translesion sentezi, TLS gibi) artmış olabilir. Örneğin, uzun ömürlü sch9 Δ mutantlar SOD2 yükselmiş ifade sergi, ve hata eğilimli DNA onarım enzimi Rev1 ²⁰ ekspresyonu azalmıştır. Burada hasarlı DNA'nın in vitro TLS değerlendirmek için şablon ve tüm nükleer özü birleştiren bir tahlil açıklar.

1. Wang ve ark tarafından tanımlanan nükleer özü hazırlayın ²¹ BCA yöntemi (Pierce) ile protein konsantrasyonu ölçmek.
2. TLS Tampon (20 mM HEPES, 7 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7.8), 200 μMdNTPs ve 100 nM içeren 50 ul (son hacim) reaksiyonları için nükleer özler 0, 5, 10 veya 20 mikrogram ekle ^5'-32 P-12-mer astar etiketli ilgi DNA hasarı (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC içeren bir 48-mer şablon tavlanmış (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') ACG TTK GTA CCA TCG-3 ', X), abasic sitesi, 8-oxo-G, vb hasarlı site, örn.
3. Karışım 30 ° C'de 30 dakika için 2.5 ul EDTA (20 mM) ve proteinaz K (10 mg / ml) 2 ul ilavesi ile reaksiyon feshedebilir.
4. Fenol ekstraksiyonu ve etanol yağış DNA arındırın.
5. Süspanse edin jel yükleme tamponu 50 ul DNA (% 98 formamid, 20 mM EDTA, boya ve).
6. % 19 poliakrilamid jeller translesion sentez ürünleri giderin.
7. Phosphorimaging (Şekil 1) kullanarak TLS niceliğini.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Biz, genellikle standart sıvı CLS analizinde yüzde 100 sağkalım olarak 3 gün CFU sayar. Sonraki günlerde yüzde sağkalım ortalama (% 50 hayatta kalma) hesaplamak için donatılmış ve en fazla (% 10 hayatta kalma) ömrü ¹² yayılmış olabilir. Ömrü yerinde canlılığı tayininde elde edilen sonuçlar genellikle sıvı CLS tahlil kullanan kişiler ile tutarlı, ancak kısmen hücreleri besinlerin sürekli maruz kaldığı gerçeği nedeniyle ortalama yaşam süresi, azaltılmış. Glikoz varlığı hücresel koruma etkinliği azaltılmış transaktivasyonunun MSN2 / 4 ve Gis1 ¹² gibi stres yanıtı transkripsiyon faktörü gösterdi engeller.

Yaşa bağımlı mutasyon sıklığı büyük ölçüde gerginlik arka plan, genetik manipülasyon, kültür koşulları, ve yaşa bağlı olarak değişir. Tablo 2 yabani tip suşu (DBY746) elde edilen tipik sonuçlar gösterir.

Bileşen	g / L
D-glukoz	20
Amonyum sülfat	5
Azot taban (-AS/-AA)	1,8
NaH2PO4	1,4
	mg / L
Adenin	80
L-Arginin	40
L-Aspartik asit	100
L-Glutamik asit	100
L-Histidin	80
L-Isoleucine	60
L-Leucine	120
L-Lizin	60
L-Methionine	80
L-Fenilalanin	60
L-Serine	400
L-Threonine	200
L-Triptofan	80
L-Tyrosine	40
L-Valin	150
Urasil	80

Tablo 1. Sentetik tam şekeri orta, SDC (NaOH ile pH 6.0 ayarlamak). 4 kat fazla histidin, lösin, triptofan ve urasil DBY746 suşu auxotrophy telafi etmek dahildir.

	3. Gün (ortalama ± SEM)	Kadar (yaşlanma sırasında)
R mi	1.76 ± 0.12 x10 -6	X10 -6 6-8
Trp + reversion	6.60 ± 1.70 x10 -8	X10 -6 1.60
Lys + çerçeve kayması mutasyonu	3.00 ± 0.78 x10 -8	X10 -6 0.70
GCRs	0.62 ± 0.10 x10 -8	X10 -6 0.30
Homolog rekombinasyon	5.55 ± 2.74 x10 -6	X10 -6 27.00
Homeologous rekombinasyon	0.12 ± 0.04 x10 -6	X10 -6 0.48

(Tablo 2). Kronolojik yaşlanma sırasında vahşi tip hücrelerin tipik mutasyon frekansları (DBY746 ).

Şekil 1 translesion sentezi (TLS) ²⁰ Sonucu. 3 gün eski sabit yabani tip faz (DBY746) ve sch9 Δ mutant hücreler Nükleer özler, 30 ° C'de 30 dakika için hasarsız ya da abasic site içeren DNA şablonları inkübe edildi. TLS ürünleri katı (hasarsız şablonu ile) veya noktalı (hasarlı şablonu ile) hatları ile belirtilmiştir. Sch9 Δ mutantlar nükleer özü gözlenen hiçbir translesion sentezi vardı. Ücretsiz primerler açık bir ok ile gösterilir.

Tartışmalar

Sıvı yaşlanma kültürler regrowth / CLS analiz karmaşıklaştırır nefes nefese fenotip ^13, bazen sergiler. Nüfusun% 90-99 daha fazla canlılığını kaybetti büyütme genellikle oluşur. Bu fenotip genellikle artmış oksidatif stres ve / veya hücre içinde azalma koruma ile ilişkilidir. Örneğin, bu fenotip frekans uzun ömürlü mutantlar sitozolik süperoksit dismutaz eksik hücrelerinde iki katına daha fazla ve büyük ölçüde azaltır (örneğin, sch9 Δ veya ras2 Δ) veya mutantlar eksprese süperoksit dismutaz ^22. Uygulamada, biz regrowth Kronolojik yaşlanma sırasında yüksek mortalite faz 3 ardışık örnekleme için canlılığı canlılığı veya istikrar bir artış olarak tanımlar.

Yaşa bağımlı frekansları farklı DNA mutasyonlarının zorlanma arka plan, genetik manipülasyon, kültür koşulları, yanı sıra regrowth / nefes nefese ve son derece düşük sağkalım önemli ölçüde bağlı olarak değişir. Ön deneyler performingthe tam ölçekli ömrü analizden önce mutasyon frekans aralığını belirlemek için mutasyon deneyleri için çeşitli kaplama yoğunluğu ile maksimum ve ortalama sağkalım süresi noktalarında yapılmalıdır. Vahşi tip suşu, her zaman, herhangi bir tedavi ya da genetik mutant ile paralel bir ömrü veya mutasyon sıklığı çalışma dahil edilmelidir deneme arası varyasyonlar için açıklanamayacağı gibi. Çoklu biyolojik kopyaları çalışmaya dahil olmalıdır;, hem sıvı ve yerinde canlılığını / mutasyon deneyleri sonuçları doğrulamak için yapılmalıdır.

Yaşa bağlı genomik instabilite birlikte birden fazla testleri kullanarak profil belirli bir DNA mutasyon tipi, odaklanmak yerine, belirli bir DNA hasarı ve DNA hasarı tamir yaşa bağlı genomik istikrarsızlığa katkıda sistem (ler) ışık tutabilir. Örneğin, diğer DNA mutasyonlarının göre brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) önemli bir artış, vahşi tip maya maya sırasında homolog olmayan sonunda bir elevationof çift iplikli kırmak ve / veya bir değer düşüklüğü katılmadan (NHEJ) düşündüren görülmektedir Kronolojik yaşlanma (Tablo 2). Yabani tip yaşlanma maya elde can1 mutasyon spektrumu (CAN1 gen sıralama) oksidatif hasarı, kronolojik yaşlanma ve hata eğilimli DNA onarım sırasında bir artış önerisi ise, uzun ömürlü sch9 Δ mutantlar, daha az oksidatif DNA hasarı ve çok azaltılmış hata eğilimli translesion sentezi ²⁰ gözlenmiştir.

Burada açıklanan yöntemlerden yaşa bağlı genomik istikrarsızlık daha fazla çalışması için harcanan olabilir. Örneğin, sükunet ve non-latent hücrelerin Allen ve ark tarafından tanımlanan yoğunluk gradiyenti yöntemi kullanarak maya sabit faz kültürlerinden izole edilebilir. ^23. Burada açıklanan mutasyon deneyleri ile birlikte, yaşa bağlı mutasyonların büyük bir kısmı, bölme hasar görmüş ya da apoptotik ^hücreleri 20,24 daha ziyade latent hücreleri, ortaya çıktığı bildirdin .