Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

Özet

Bir In vivo Görüntüleme protokolü, dorsal kök ezmek aşağıdaki birincil duyusal aksonlar izlemek için tarif edilir. Prosedürleri geniş alan floresan mikroskopi ve thy1 YFP transgenik fareler kullanan ve akson rejenerasyonu PNS ve akson etkileşimleri CNS arayüzü ile 4 cm üzerinde tekrarlanan görüntüleme izni.

Özet

Spinal kök yaralanmalar yaralandı primer duyusal aksonlar, kronik ağrı ve kalıcı duyu kaybı, omurilik içine yeniden başarısız olur. Omuriliğe dorsal kök (DR) akson Rejenerasyon dorsal kök giriş bölgesi (DREZ), merkezi sinir sistemi ve PNS arasındaki arayüzü önlenmiş olur. DREZ az rejenerasyon önlemek için moleküler ve hücresel olayların anlayışımız, sinir hasarı ile ilişkili karmaşık değişiklikler, postmortem analizleri sonucuna çünkü kısmen eksik. Akson rejenerasyonu gibi dinamik hücresel süreçleri, en iyi gerçek-zamanlı olarak olaylar her canlı hayvanın çoklu gözlem yakalama teknikleri ile çalıştı. Bizim seri nöronlar in vivo monitör yeteneği, optik ve fare transgenik devrimci yenilikler dramatik nedeniyle artmıştır . Thy1-GFP transgenik farelerin birkaç satır, nöron altkümelerini genetik olarak farklı floresan renkler etiketli olduğu, bireysel nöronlar in vivo ¹ imaged izin verecek. Bu fareler, ^{kas, 2-4 ve} 5-7 beyin in vivo görüntüleme için yaygın olarak kullanılan ve statik analizler çözülmesi olamayacağını fizyolojik mekanizmaları yeni bakış açıları sağlamıştır . Ancak son zamanlarda yaşayan omurilik nöron görüntüleme çalışmaları başladı. Lichtman ve arkadaşları ilk kez geniş alan mikroskobu ^8,9 ile yaralı dorsal kolon (DC) aksonlar takip ederek kendi fizibilite gösterdi. Multi-foton, derin yerleştirilmiş DC akson in vivo görüntüleme mikroglia ve kan damarlarının ¹⁰ başarılı olmuştur. Son birkaç yıl içinde, biz geniş alan mikroskobu ve thy1-YFP farelerin Y hattı kullanılarak DR akson rejenerasyonu izlemek için in vivo görüntüleme uygulanmasında öncülük etmiştir. Bu çalışmalar ¹¹ omurilik içinde DR aksonlar rejenere engellenir neden hakkında bir roman hipotez için bize yol açmıştır.

Thy1-YFP farelerin Y doğrultusunda, farklı YFP + aksonlar yüzeysel birkaç aksonlar eş zamanlı olarak takip edilmesine olanak sağlamaktadır konumlandırılmış. Biz DREZ gelen DR aksonlar daha iyi servikal spinal kord daha lomber imaged olduğunu öğrendim. Bu raporda biz yenileyici DR akson başarılı uzun süreli ve tekrarlanan görüntüleme sağlamak için yararlı bulduk çeşitli stratejiler açıklanmaktadır. Bunlar tekrarlanan entübasyon ve solunum kesintisi ortadan kaldırmak yöntemleri, cerrahi ile ilişkili stres ve skar oluşumu en aza indirmek ve fototoksisite olmadan istikrarlı yüksek çözünürlükte görüntüler elde edin.

Protokol

1. Mikroskop kurmak ve görüntüleme hazırlık

1. Bizim görüntüleme, bir hızlı çekim ve soğutmalı CCD kamera Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilen bir Leica MZ16 floresan stereomikroskopta oluşur ayarlayın.
2. Termostatik kontrollü bir ısıtma yastığı hazırlayın ve 32,5 ° C, hayvanın vücut ısısını korumak için sırasında ve cerrahi sonrası çıkış ayarlayabilirsiniz.
3. 32,5 ° C, ameliyat sırasında omurilik sulama için önceden Sıcak steril Ringer solüsyonu veya yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF).
4. Ksilizin (8 mg / kg) ve ketamin (120 mg / kg) kokteyl intraperitoneal enjeksiyonu ile hayvan anestezisi.
5. Küçük hayvan kesme makineleri ile üst sırt Tıraş ve pamuklu çubuklar, traş alana epilasyon losyonu küçük bir damla yayıldı. Dakikalar sonra,% 70 etanol batırılmış gazlı bez sünger kullanılarak uygulanan losyon çıkarın.

2. Laminektomi ve L5 dorsal kök cerrahi maruz kalma

1. Isıtmalı (32,5 ° C) ped hayvan koyun ve% 70 etanol batırılmış çubuklar ile cilt dezenfekte edin.
2. Arka cilt stereomikroskopta parlak alan aydınlatma altında, orta hat insizyonu (3 cm 2) gerçekleştirin. Gerekirse, kanamayı durdurmak için pamuklu çubuklar kullanın.
3. Altta yatan bel omurları ortaya çıkarmak için omurilik kas yansıtmaktadır.
4. Sağ taraflı hemi-laminektomi küçük rongeurs kullanarak L3-S1 spinal segmentler Açığa. L2 vertebra (2 rostrally kalça iliak düzeyinde L5 vertebra sağ dorsal kısmı (L5 DRG yeri) çıkarırken, lomber ve sakral spinal kord 4-6 segmentleri açığa kısmi laminektomi tarafından oluşturulan son kaburga vertebra kaudal). Ilık steril Ringer solüsyonu ile kavite serpmek.
5. Vertebral kolon düzleştirmek için bir destek yastığı (rulo pamuk gazlı bez) hayvan yerleştirin. Maruz alanını genişletmek için geri çekme kancaları kullanın.
6. Alternatif olarak, bu noktada (ilk ip anestezik enjeksiyon sonrası yaklaşık 30 dakika, hayvan tam anestezi tutmak için bir ek (0.5x) subkutan enjekte edilmelidir. Gaz anestezi (% 2-4 izofluran 0.5L/MIN oksijen ) 1 saatten daha uzun görüntüleme oturumları sırasında tekrarlanan anesthetization için kullanılabilir.

3. Rizotomi / Dorsal kök ezmek

1. YFP aksonlar (+) etiketli görselleştirmek için floresans uyarma geçin.
2. Alt-Q (26ga.) iğne ucu kullanarak, dura L5 dorsal kök (DR) üzerinde küçük bir kesi yaparlar. Ringer çözeltisi ile tekrar tekrar serpmek ve pamuklu çubuklar ile nazikçe temizleyin.
3. Ezilmiş olmak site belirleyin ve subdurally bir tarafında ince bir pens eklemek (Dumont # 5).
4. 10 saniye için L5 kök medial kısmını elinde forseps yavaşça ama sıkıca kapatın ve forseps yavaşça bırakın.
5. Fizyolojik çözeltisi ile tekrar tekrar yıkayın ve pamuklu çubuklar ile nazikçe temizleyin.

4. Görüntü edinimi ve post-op prosedürleri

1. Hem de düşük ve yüksek büyütme ezmek sonra önce sağ ve ezilme sitesi ve DREZ da dahil olmak üzere tüm açık alan birden fazla görüntü elde edin.
2. Görüntüler tek bir anlık görüntü veya 30 gün içinde alınan 10 ila 20 kare birden fazla akarsu olarak elde edilen 40-ms maruz kalma süresi. Odak görüntüler daha sonra seçilir ve genel bir montaj daha sonra Photoshop kullanarak oluşturulur.
3. Skar oluşumu en aza indirmek için, sıkıca maruz omuriliğin üstünde, ince sentetik matris membran (Biobrane) bir parçası, yapay dura uygulamak. Omuriliğe yapışık böylece maruz omurilik penceresi tam uyacak şekilde parça kesmek için emin olun.
4. Steril 5-0 sütür ile kas kapatın ve yara klipler ile orta hat kesi yakın.
5. Ringer solüsyonu (0.3-0.5-ml subkutan) enjekte edilir, postoperatif analjezi (0.05 mg / kg) 2 gün süreyle subkutan olarak her 12 saat gibi Buprenorfin yönetmek.
6. Bir ısıtma yastığı (34 ° -35 ° C) düzelene kadar hayvan tutun.

5. Tekrarlanan görüntüleme

1. Hayvanın anestezi ve yara klipleri ve dikişlerle çıkarın.
2. Yapay dura ve ince sentetik matris membran yamaları çıkarın ve daha sonra yeniden kullanmak için Ringer çözeltisi içeren steril bir tüp içinde saklayın.
3. Sub-Q iğne ve ince forseps kıvrık ucu ile birikmiş bağ dokusu skar yavaşça çıkarın. Sıcak Ringer solüsyonu ile sık sık serpmek.
4. Ezmek sitesi ve DREZ dahil olmak üzere, ameliyat alanını yeniden ortaya çıkarmak, daha önceki oturumlarda görüntülü YFP + aksonlar taşınmaya ve Bölüm 4 anlatılan işlemleri tekrarlayın.

6. Temsilcisi sonuçları:

Biz bir transection yaralanma sonrası yeniden etmedi ise, hemen hemen tüm YFP + aksonlar site üzerinden büyüdü3 gün sonra ezilme yaralanması (Şekil 1) ^11. Tipik olarak, ezilme sonraki gün, proksimal güdük aksonlar ve aksonlar uygun hasarlı olduğunu doğruladı ezmek için distal aynı aksonlar, parçalanma / dejenerasyon ölüyor geri dejenerasyon görülmektedir (örneğin, Şekil 1, 3 ve 5 Gün) . Birçok ek kriterler, net bir şekilde ayrılan veya yaralanma kurtarıldı aksonlar rejenere aksonları ayırt etmek için uygulanır. Bunlar aşağıdakiler dahil: (1) yenileyici aksonlar YFP floresan olmayan kısmını bir genişleme + proksimal ve distal dejenerasyon (ezilme sitesi dolumu floresan sitoplazma nedeniyle etiketsiz boşluğu daralması kontrast nedeniyle ezilme sitesi akson gösteriyor (2) aksonlar yaralanma) hayatta; yenileyici aksonlar, daha az parlak, floresan, ve yaralanma hayatta aksonlar daha dalgalı çok ince (3) yenileyici neurites ince ve akson dejenere floresan parçalarının daha loş floresan üzerinden (4) aksonlar hayatta kalan veya ayrılan aksine, yenileyici aksonlar DREZ durdurmak; genişletilmiş ve (5) aksonlar hayatta kalan veya ayrılan aksine, yenileyici aksonlar Ranvier düğümleri sergilemek yoktur. Şekil 1, ezilme sonra hemen dört yüzeysel YFP + aksonlar (renkli oklar A1) gösterir. Üç gün ezmek sonra, dört aksonlar ezmek sitesi (A2) ile büyüyen tek bir neurite uzanır. Beş gün sonra ezilme, neurites stabil kalır ve bu veya başka bir proksimal aksonlar (A3) herhangi ek bir büyüme var.

Yozlaşan bir akson (yani, endoneurial tüpler) daha kalın ve parlak floresan parçalarının üzerinden uzun ezmek sitesi geçti ve yenileyici neurites ezmek (yaklaşık 2 3mm / gün) sonra 4 gün gibi erken DREZ az ¹¹ varmak. Bu aksonlar ve ipuçları iki hafta daha (Şekil 2) için her iki ya da üç gün tekrarlanan görüntüleme ileri büyümeye veya geri çekilmiyor yaptığı ortaya, ama hareketsiz kaldı. Sadece gözle görülür bir değişiklik, bazı akson ipuçları ve miller şişme oldu. Bu gözlemler, bu nedenle şaşırtıcı derecede hızlı ve kronik immobilizasyon DREZ yenileyici aksonlar göstermektedir.

Şekil 1: 5 gün boyunca, dorsal kök ezmek yerinde L5 DR YFP + aksonlar tekrarlanan görüntüleme . L5 kök medial kısmı ezilmiş (kırmızı ok ucu) ve günlük 0, 3, ve sonra 5 ezmek görüntülendi. Çarpıldı alanı sağ panelleri (A1-A3) büyütülmüş.

Şekil 2: akson Tekrarlanan görüntüleme DREZ L5 kök ezmek sonra 20 gün içinde geldi Gün 4, üç aksonlar (renkli oklar) DREZ geldi. Bu akson ipuçları aynı yerde kalır ve Gün 7, 9, 13, 15, ve 20 sonraki görüntüleme oturumlarda benzer bir görünüme sahip. Diğer akson ipuçları ve simgesel (yıldız) göreli bir akson ucu Pozisyonlar görüntüleme oturumları arasında akson motilite belirlemek için kullanılır.

Tartışmalar

Doğrudan yaşayan fareler Görüntüleme DR rejenerasyon özellikle sonraki görüntüleme oturumlarda birden fazla invaziv cerrahi ve anestezi prosedürleri takip geniş bir alana akson büyümesini izlemek için önemli bir dorsal laminektomi gerektirdiğinden zordur. Çeşitli stratejiler, bu zorlukların üstesinden gelmek için yardımcı oldu. İlk olarak, başarılı bir görüntüleme, anestezi ve kanama süresini en aza indirmek fare mortalite (yaklaşık% 25) azaltılması gereklidir ve titiz post-op bakım. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(2-4 aylık, cinsiyet ya) H hattı thy1-YFP	Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME)	003782
Xylazine (AnaSed enjeksiyon, steril çözüm)	Lloyd Laboratuvarları, (Shenandoah, LA)	4811	8 mg / kg
Ketamin (Ketamin hidroklorür enjeksiyon, USP)	Hospira, Inc (Lake Forest, IL)	2051	120 mg / kg
Buprenorfin (enjektabl Buprenex) (0.05 mg / kg)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc (Richmond, VA)	7571
Küçük hayvan saç kesme makineleri	Oster Professional (McMinnville, TN)	76059-030
Saç kaldırma losyon	Kilise ve Dwight Co (Princeton, NJ)	Bebek Yağı ile Nair
Tül süngerler	Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA)	22-362-173
Pamuklu çubuklar	Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA)	14-960-3Ç
1 ml Şırınga	Becton, Dickson ve Şirket Franklin Lakes, NJ)	309602
Subkutan (Sub-Q) iğneler, 26ga.	Becton, Dickson ve Company (Franklin Lakes, NJ)	305115
Bahar makas ve forseps	Güzel Bilim Araçlar, (Foster City, CA)
2.5 mm kavisli rongeurs	Güzel Bilim Araçlar, (Foster City, CA)	16221-14
Ringer Enjeksiyonu USP	B. Braun Medical Inc (Irvine, CA)	BBR-L7502
Steril serum fizyolojik solüsyonu	APP İlaç, (Schaumburg, IL)	918610
İnce sentetik matris membran (Biobrane)	Bertek İlaç, (Morgantown, WV)	62794-096-251
Yapay dura	Gore MVP Dura Substitute, WL Gore and Associates, izin vermeme (Flagstaff, AZ)	1MVP40
5-0 ipek sütür	Ethicon, Inc (Somerville, NJ)	K-580
Yara klipleri	Mükemmel - Ets Bruneau, (Burnea Fransa)	A75
Floresan stereomikroskopta	Leica Microsystems, (Wetzlar, Almanya)	MZ16
CCD kamera	Hamamatsu, (Bridgewater, NJ)	ORCA-RX2
Sıcaklık Kontrolör	Dünya Hassas Aletler (Sarasota, FL)	ATC 1000
Metamorph yazılımı	Moleküler Aygıtlar, (Sunnyvale, CA)
Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA