FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

Özet

Fonksiyon-Spacer-Lipid (FSL) yapıları canlılık kaybı olmadan, canlı hücreler ve virionlar yüzey özelliklerinin değiştirilmesine izin verir. Bu yöntem, sadece basit bir hücre / virion ve spontan ve kararlı bir yüzey dahil oluşur FSL inşa çözüm temas gerektirir.

Özet

Değiştirmek / biyolojik yüzeyler görselleştirmek ve ardından bir dizi in vitro ve in vivo ortamlarda değiştirilmiş hücre / virion çalışma yeteneği belirli molekülleri ya da tüm varlık işlevi içine daha fazla anlayış kazanıyor esastır. Biyolojik yüzey modifikasyonu çalışmalar genellikle organizmanın genetik mühendisliği ya da hücre yüzeyinde ^1,2 kimyasal moieties kovalent eki sınırlıdır. Ancak bu geleneksel teknikleri, kimyasal reaktanları hücre maruz kalmaktadır, ya da, istenilen sonucu elde etmek için önemli bir manipülasyon, bunları hantal hale gerektirir ve onlar da yanlışlıkla değiştirilmiş hücre canlılığı / işlevselliği etkileyebilir. Zararsız hücre yüzeyi değiştirmek için basit bir yöntem gereklidir.

Son zamanlarda yeni bir teknoloji, code Teknoloji yeni yapıları üç bileşenden oluşan bir dizi tanıttı: fonksiyonel bir kafa grubu (F), bir ayırıcı (S) ve lipid kuyruk (L) ve Fonksiyon-Spacer-Lipid veya FSL olarak bilinir constructs3. Boşluk (S), suda dağılabilir bir yapı sağlamak üzere seçilen, ancak kendiliğinden ve istikrarlı bir şekilde bir zar içine dahil edecektir.

FSL (F), bugüne kadar kan grubu ile ilgili belirleyiciler, sialik asitler, Hyaluronan'ın polisakkaritler, fluorophores, biotin, radiolabels ve peptidler bir dizi ^3-12 dahil olmak üzere sakkaritlerin, bir dizi fonksiyonel moieties yapı. FSL yapıları, embriyoları değiştirerek, sperm, zebrafish, epitel / endometrium hücreleri, kırmızı kan hücreleri ve virionlar hücre adezyon / etkileşim / ayırma / immobilizasyon değiştirmek için, kalite kontrol sistemleri ve teşhis paneller, oluşturmak için kullanılır, ve in vitro ve in edilmiştir hücre / virionlar ^3-12 in vivo görüntüleme.

Hücre / virionlar değiştirme süreci, genel ve son derece basit. En yaygın bir yöntemdir, FSL 37, 1-2 saat boyunca ^inşa ° 4-10 C için bir çözüm ile hücre inkübasyon (lipid ücretsiz medya ). İnkübasyon sırasında FSL membran dahil kendiliğinden oluşturur ve bu süreç tamamlandıktan. Yıkama isteğe bağlı. Virionlar kodevirions ¹⁰ iken, FSL yapıları değiştirilmiş hücreler, ^kodecytes 6-9 olarak bilinmektedir .

Olduğu gibi doğrudan haşlama ve kodecytes / kodevirions deneysel hayvan modelleri ^7,8,10 FSL oluşturur. Tüm kodecytes / kodevirions F benzer parçaları ^7,8,10,11 yeni bir işlev kazanıyor süre normal canlılık ve fonksiyonelliği korumak için görünür.

Biyouyumlu medya, hücre zarları içerisinde kendiliğinden birleşme ve belirgin düşük toksisite dispersiyon kombinasyonu, FSL hücreleri ve virionlar çalışma için değerli bir araştırma araçları inşa yapar.

Protokol

Aşağıdaki protokol biyolojik membranlar içine FSL yapıları ekleme (Şekil 1) genel prosedürü anlatılmaktadır. Basitlik için protokolü sadece% 100 konsantrasyonda hücreleri (kodecytes) sevk edecektir. Ancak, vadeli hücreler virionlar (kodevirions) veya organizma veya hücresel yapılar ve seyreltici kendi konsantrasyonu ile değiştirilebilir önemli değil, test, kontrol ve deneyler arasında her zaman tutarlı olması koşuluyla. Tipik olarak kırmızı kan hücreleri ile hematokrit% 80, ama virionlar, embriyo ve diğer hücreleri genellikle% 1'den daha az. Bu yöntem çok sağlam ve herhangi bir varyasyon tarafından kullanılan modifiye membranlar üretecek, ancak arıtma, özel uygulamalar için gerekli değişiklik derecesi optimize etmek ve standartlaştırmak için gerekli olacaktır.

1. FSL, hazırlanması oluşturur

1. Seyreltici 1.0mL (ya da ürün eklemek belirtildiği gibi) eklenmesi ile ürün flakon FSL inşa stok solüsyonu ilk sulandırmak kuru FSL ürün (Tablo 1) hazırlamak için. Kısaca sonikasyon (30 saniye). Bu 100 mcL steril kaplar içine aliquoted ve 2-8 ° C ile bir hafta kadar, ya da 3 aya kadar donmuş muhafaza edilebilir bir 1mg/ml çözüm hazırlayacaktır.
2. Çalışma hazırlamak için FSL miseller homojenize (30 saniye) stok solüsyonu kısaca sonikasyon kullanmak hemen önce, ekleme için çözümler oluşturmak. FSL inşa tampon (tercihen yüksek hidrofobik lipidler veya malzeme içermeyen), istenirse bir menzil içinde veya gerekli konsantrasyonu sulandırınız.

Notlar:

1. FSL yapıları genellikle, lipit içeren medya hücrelerin içine gireceğiz ama genellikle PBS veya diğer lipid ücretsiz medya daha çok 50X yüksek FSL çalışma konsantrasyonları gerekecektir.
2. Çalışma aralığı dilüsyonları uygulama tespit yöntemi duyarlılığı, FSL yapının türüne ve gerekli modifikasyon derecesine bağlıdır. Genelde seyreltme aralığı 10-500 karbonhidrat FSL yapıları için seyreltici mL başına FSL mikrogram ve fluorophores ve biyotin gibi diğer FSL yapıları için 1-100 mg / ml arasında olacak.
3. Birden fazla FSL inşa içeren ekleme seyrelticiler hazırlanıyor, sadece normal çalışma konsantrasyonda aynı seyreltici yapıları birbirine eklemek. Bir yapı diğerinden daha çok daha yüksek konsantrasyonda ise, konsantrasyon bazı ayarı (artış) daha az bir yapı için gerekli olabilir. Alternatif yapıları daha az izlenen, en yüksek konsantrasyon ilk inşa, tercihen sırayla eklendi olabilir.
4. FSL inşa konsantrasyonu 1000 mcg / ml üzerinde bir hücre zarı içine önemli miktarda lipid tanıtmak ve hücrenin şeklini değiştirmek veya lizis için daha duyarlı hale getirebilir.
5. FSL inşa çalışan çözümler 2-8 ° C'de saklanır ve bir kaç gün içinde kullanılmalıdır.
6. FSL yapıları su içinde seyreltilmesi olabilir ama istikrar düşer ve birkaç saat içinde kullanılması gerekir. Prospektüste sulandırıldıktan seyreltici olarak su belirtirse flakonda ürün aynı zamanda tuzları (as prospektüste belirtilen) içerecektir.

2. Membranlar içine FSL Construct (ler) yerleştirilmesi

1. İlk hücreler santrifüj yoluyla bağlanmamış lipidler FSL değişiklik ücretsiz yıkama ve yıkama çözüm olarak PBS veya lipid ücretsiz cep medya kullanarak.
2. Paketi hücreler veya seyreltici 100 mcL askıya.
3. Aynı zamanda, ideal olarak iyi huylu, ancak ilgili FSL yapısı değiştirilmiş hem de değiştirilmemiş hücreleri (FSL çözüm yerine PBS ile inkübe) ve / veya hücreleri olmalıdır kontrolleri hazırlar.
4. Hücreleri için uygun bir seyreltme FSL çözümü (1 veya daha fazla FSL yapıları içeren) 100 mcL ekleyin ve 37 1-2 saat inkübe ° C Benzer bir sonuç 25 6 saat inkübasyon elde edilebilir 4 ° C veya gece (18 saat) ° C - ağır hücre süspansiyonları kullanılır karıştırma birkaç saatte tavsiye edilir.
5. Herhangi bir ücretsiz FSL yapıları kaldırmak ve uygun bir süspansiyon hazırlamak için (isteğe bağlı) PBS veya medya ile iki kez yıkayın.

Notlar:

1. Seyreltici hücreleri askıya almak için kullanılan hücre kültür ortamı, PBS, hücre depolama çözümleri, vb olabilir, ama tercihen lipit (örneğin fetal buzağı serumu) veya deterjan (örneğin TWEEN) olmadan.
2. Farklı birimler (100 mcL daha) oranları (01:01 hücre / FSL çözüm daha) veya inkübasyon süresi ve sıcaklığı koşulları tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kullanılan aynı oran, konsantrasyon ve hacim olarak kullanılıyor olabilir.

3. Kullanma ve Görselleştirme

1. Kodecytes lipid ücretsiz medya FSL değişikliği süreci tamamlandıktan sonra 4-8 ° C'de saklanır veya kullanılmış olabilir.
2. Kodecytes ve kodevirions genellikle değiştirilmemiş hücre / virionlar olarak aynı şekilde davranır ve Handl olabilired ve normal test sistemleri (mikroskopi, seroloji, flow sitometri, vb.) altında incelendi. Genellikle çözücü / deterjan / membranlarda lipit yapıları Zehir lipidler kaçınma dışında hiçbir özel gereksinimleri var.

Notlar:

1. Hücrenin yaşam için lipid ücretsiz medya saklandığı takdirde, yapıları, kırmızı hücreler gibi inaktif hücreleri, membran kalır. Aktif membranlara hücrelerinde hücre zarı faaliyet oranda bağımlı bir yapıları, içselleştirilmiş ve metabolize olacaktır.
2. Ölü hücreler genellikle FSL yapıları yüksek düzeyde içeren, bu canlı hücreler cansız hücreleri ayırmak için kullanılabilir.
3. Kodecytes lipid (veya in vivo olarak kullanılan) saklanır içeren medya / serum / plazma yapı gibi ortamlarda, yavaş yavaş, saat ya da gün bir süre boyunca sıcaklık ve lipid konsantrasyonları / kompozisyonlar bağlı olarak, membran Zehir olacaktır.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

1. Aşağıdaki temsilcisi sonuçları bağlıdır inşa kullanılmıştır (Tablo 1), takılı konsantrasyon ve algılama sistemi (ler) bağıl duyarlılık ve özgünlük. FSL yapıları, genel olarak 1 saat sonra hücrelerin içine gireceğiz ama her durum için en uygun koşulların oluşturulması gerekmektedir.
2. FSL yapıları, canlı hücreleri ^çeşitli 3-9,11,14 dışında etiketlemek için kullanılabilir . Şekil gösterilen örnekler farklı aşamalarında az 2 embriyolar (kırılgan bir hücre gibi) kullanılmıştır, ancak diğer hücrelere (Şekil 3) veya zarflı virionlar (Şekil 4) de etiketli olabilir. FSL-biotin ve diğer FSL yapıları (Şekil 5) kendi varlığını göstermek için ikincil bir algılama sistemi (genellikle avidin / antikorlar / lektinler) kullanımı gerekebilir FSL-Floresein, doğrudan etiketleme yüzeyler (Şekil 2-4) sağlar .
3. Kırmızı hücrelerin ^4-9 (Şekil 6) da dahil olmak üzere hücreleri, insan veya hayvan özgüllüğü Kan grubu işaretleri eklenebilir. FSL miktarı bir kodecyte yapı olarak kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir ^4-6, antikor kantitatif için kodecytes yapılabilir (Tablo 2 ve Şekil 6). Gerçek hücre kaynağı önemli değildir, onlar herhangi bir türün, hatta antikor kaynağı olarak aynı kökenli, böylece sadece uyumsuz bir antijen sağlamak ^FSL 7,8 (Şekil 6) tarafından tanıtılan .

Tablo 2, üç farklı FSL-A (üç) kırmızı hücre kodecytes Temsilcisi serolojik reaksiyonlar monoklonal anti-A dilüsyonları karşı test . FSL-A (üç) grup O kırmızı hücreler eşit hacmi ile inkübe 50 mcM çözüm 1:512 dilüsyon monoklonal anti-A tarafından tespit olabilir güçlü bir antijen pozitif hücreler, üretti. 5 - 10 kat daha düşük FSL-A (üç) çözümleri, daha az kan grubu A antijeni ifade kodecytes üretti.

Şekil 1 FSL inşa genel bakış . Bir çiçek FSL yapıları gibi üç ana bileşenden oluşur. FSL inşa halinde fonksiyonel kafası farklı biyolojik olarak fonksiyonel gruplar, çeşitli membran uzak F boşluk neden su dispersiyon geliştirmek ve serum ile non-reaktif olarak tasarlanmış bir boşluk (S), (F) diacyl lipit sağlar yapı kendiliğinden yüzeyler dahil. (I), kan _grubu, 3 GB ^(veya P k) FSL-GB3 epitop Galα4Galβ4Glcβ trisaccharide. (II) FSL-A (üç) kan grubu A trisaccharide epitopu GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-Floresein. (IV) tek bir biotin F benzer parçaları ile FSL-biotin. Yapı IV ayırıcı carboxymethylglycine-adipat dayalı iken, I-III yapıların fonksiyonel grup dioleoylphosphatidylethanolamine aktive adipat türev (DOPE) konjuge.

Şekil 2 FSL-Floresein fare embriyoları etiketli. Tüm görüntüler canlı embriyo zona pellusida (ZP) (yani FSL inşa içinde embriyo etiket ZP geçirilir) sağlam olduğu zaman etiketli. Görüntüler I-IV FSL-Floresein asit tyrodes yazılan etiketleme ile ZP serbest ZP-embriyoların. Özdeş boyama embriyolar ZP sağlam veya ZP ücretsiz FSL ile değiştirilmiş olup olmadığını ne olursa olsun meydana gelir. Embriyolar, 2 saat 37 ° C yöntem serum serbest hücre kültürü medya tarafından doğrudan, FSL-Floresein etiketli yıkanır ve floresan mikroskobu altında incelendi. (I) ZP ücretsiz iki hücreli fare embriyo, aynı zamanda klasik yoğun kutup vücut boyama gösteren. (II-III) ZP ücretsiz dört hücreli, sekiz hücreli fare embriyoları, çıkışları olan hücreleri gösteren hem de gölgeli boyamaide mikroskop odak düzlemi. (IV) ZP ücretsiz 16 hücreli fare embriyo. (V) hem de embriyo ve zona etiketli ZP sağlam fare blastosist embriyolar (d4-d5).

Şekil 3 FSL-Floresein ve zebrafish ^14. (I) Microangiography 52 hpf (saat sonra döllenme) Zebra balığı larvaları FSL-Floresein dolaşımını doğrudan enjekte. Zebrafish damarsal lekeli. (II) FSL-Floresein heterojen Zebra balığı böbrek doku hücrelerinin (ZK kodecytes), ex vivo oluşturulan mikro-52 hpf alıcı Zebra balığı dolaşımı içine enjekte edilir. ZK kodecytes in vivo gözlemler görüntüleme 2 saat sonrası enjeksiyon yapıldı time-lapse mikroskobu ile floresan altında damarsal. Gösterilen büyük yavaş hareketli veya hareketsiz hücreler (portakal oklarla gösterilen) ve hızlı hareket eden hücreler (yeşil oklarla belirtilen hareketi nedeniyle bulanık görüntüleri) ile tek bir video karesi. Etiketleme, davranış ve ZK kodecytes biodistribution in vivo gözlem gerçek zamanlı sağlar . (III) FSL-Floresein Oral alımı çeker tarafından 5 gün medya içeren FSL-Floresein zebrafish embriyolar elde etti. Yıkama hiçbir FSL yapıları (en az 6 saat gereklidir, ancak birkaç gün için olabilir) içeren ortama embriyoların transferi ile elde edilmiştir. (IIIa) Aydınlık alan mikroskobu bitişik floresan görüntü (IIIb) karşılık gelen FSL-Floresein tedavi zebrafish. Fluoresence tercihen bağırsak yer oldu. Boyama, tedavi edilmeyen kontrol embriyolar (IVa ve IVb) gözlenmiştir.

Şekil 4 virionlar ¹⁰ VSV ve H1N1 FSL-Floresein etiketleme. (I) veziküler stomatit virüsü (VSV), doğrudan 37 10 mcg / ml 2 saat FSL-Floresein etiketli ° C,% 4 paraformaldehid ve ardından flow sitometri ile tespit izledi. VSV kodevirion Mesaj FSL etiketleme hiçbir arıtma gerekli oldu. (II), insan, A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) ile enfekte domuz testis hücrelerinin Flow sitometri FSL-Floresein kullanarak etiketli kodevirions. Enfekte olmamış hücrelerdeki siyah bir çizgi olarak görülür, floresan hücre (kırmızı çizgi) ST hücreleri sonuçları ile H1N1 kodevirion füzyonu.

Şekil 5 etiketli avidin ^7,8 ile FSL-biotin etiketli hücreleri ve sonraki görselleştirme. Tüm hücreler ilk 1 saat 37 ° ° C FSL-biotin ile etiketlenmiş sonra avidin etiketli florofor floresan mikroskopi için monte yıkanmış ve ıslak ile reaksiyona yıkanmış edildi. (I) bir fare embriyo blastosist konfokal görüntü Derlenmiş. (II) önceki görüntü embriyo Orta konfokal dilim. (III) Canlı hareketli insan sperm bulanıklık kendi hareketinin bir sonucu olarak ortaya çıkar. (IV) Sabit (% 4 paraformaldehid mesaj ekleme) İnsan sperm. (V) İnsan eritrosit. (VI) Sabit (% 4 paraformaldehid ekleme öncesi) RL95 insan endometrial karsinom. (VII) Sabitlenmemiş RL95 endometrial insan karsinom hücre hattı. (VIII) Biotin RBC (VIIIb) alanında mevcut iki kodecytes belirlenmesi, floresan altında görüntülenen aynı alanda ise 2 saat (VIIIa), ışık mikroskobu altında incelendi bir alanı temsil eden kodecytes intravenöz infüzyon yazılan alınan bir kan örneği gözlenen kodecytes görüntüsü. Etiketsiz hücreleri kodecytes oranının hesaplanması hayatta kalma bir göstergesi olarak kullanmak olabilir. (IX) Canlı insan endometrial biotin kodecytes avidinylated boncuk bağlanarak tarafından görüntülendi.

Şekil 6 serolojik profil için kan grubu belirteçleri eklemek için FSL-Karbonhidrat. (I) İnsan kırmızı hücre Galili kodecytes FSL-Galili bir konsantrasyon (500 mg / ml) ile oluşturulan ve insan serum dilüsyonları karşı test edilmiştir. İnsan kırmızı kan hücrelerinin doğal xenoantigen Galili antijen ile meydana gelmez. Böyle kodecytes kantitatif serum antikor düzeylerine kullanılabilir. Bu örnekte donör 01:32 bir anti-Galili titresi tespit edildi. (II) antikor tespit etmek için FSL azalan seviyeleri ("antijen titreleri"), optimal bir antijen düzeyi kodecytes oluşturarak (bu örnekte Le ^bir) tespit edilebilir. Hücreler antikor düzeyi belirli bir titresi aştığında olumlu bir sonuç vermek için oluşturulabilir. Pozitif sonuç vermesi için gerekli FSL antijen antikor kalite ve seviye tespit edilmelerini bağlıdır. Karbonhidrat antijenleri için 100 mcg / mL FSL çözüm genellikle güçlü bir pozitif reaksiyon neden olur. (III) İnsan grubu O kırmızı hücreleri belirli bir düzeyde bir karınca için modifiye edilmiştirigen (A kodecytes standardize), doğru ve tekrarlanabilir insan serumunda anti-A ölçmek için kullanılır. Bu örnekte anti-A grubu O serum test titresi 1:32 ve kodecytes donör kendi kırmızı kan hücrelerinin hazırlanmıştır. (IV) Kan grubu A ve B antijenleri, aynı anda tek bir grup O kırmızı hücre _örneği takılı zayıf _bir B zayıf kodecytes oluşturmak için kullanılır. Bu kodecytes ABO kalite kontrol amaçlı kullanılabilir. Bu sonuç, özel olarak formüle edilmiş anti-A ve anti-B reaktifler karşı test edilmiş ve zayıf reaksiyonlar beklenen verir _zayıf bir _B zayıf kodecyte analizi gösterir .

Tartışmalar

FSL yapıları ile değiştirmek hücreleri ve virionlar çok basit ve sağlam bir ^tekniğin 3-11 . Tanımlamak ve FSL değiştirilmemiş hücrelerden değiştirilmiş hücreler ve virionlar inşa ayırmak için sırasıyla kodecytes ve kodevirions ^6-10 denir, ama tanıtıldı fonksiyonel grup, membran üzerinde mevcut olması gösterilebilir sadece. Kodecytes FSL yapıları farklı konsantrasyonları ile yapıldığında, örneğin 15 mg / ml kodecytes ya da birden fazla FSL sonra ise kombine bir dönem, onları oluşturmak için kullanılan FSL inşa çözüm konsantrasyonu anılacaktır. A + biotin kodecytes ^7,8 gibi. Farklı hücreler açıklama hücre tipi de dahil olmak üzere, karşılaştırılabilir zaman tavsiye edilir, örneğin kırmızı hücre biotin kodecytes veya endometrium biotin kodecytes ^7,8.

Yerleştirme işlemi, (farklı oranlarda olsa da) çok sağlam ve ekleme olmakla birlikte 4 ila geniş bir sıcaklık aralığında meydana gelir - 37 ° C ve saat dakika içinde, temas süresi, sıcaklık, FSL konsantrasyonu (tekrarlanabilir ekleme sıkı kontrol elde etmek için ) seyreltici formülasyonu dahil olmak üzere, daha az oranda hücre konsantrasyonu gereklidir. Bugüne kadar, tüm FSL yapıları aynı tekniğin ^4-11 hücreleri değiştirmek için kullanılır olabilir, ancak belirli koşullar hücre / modifiye edilmesi virionlar iş akışı ve / veya optimal işleme gereksinimleri için daha elverişli olması beklenmektedir. . Istenen etkiyi elde etmek için tam FSL konsantrasyonu ⁴ kullanıcı tarafından tespit edilmesi gerekmektedir. Çıkan FSL değiştirilmiş hücreler inşa / virionlar genellikle biyolojik ya da analitik sistemler ^4-11 değiştirilmemiş bir hücre / virion aynı şekilde kullanılabilir. FSL yapıları lipid çözümler ^7,8 ile temas ettiğinde yavaş yavaş değiştirilmiş yüzeylerden Zehir, ya da ^aktif hücreler 11 tarafından tüketilmesi olarak, bu konularda zaman dönemler boyunca elde edilen sinyal ya da aktivite düzeyi açısından dikkate alınmalıdır. Ekleme fiksatif lipid salınımlı solventler içermez ve fonksiyonel grup fiksatif ile uyumlu sonra Kodecytes (örneğin glutaraldehid / formalin) sabit olabilir. Alternatif olarak sabit hücreler FSL yapıları değiştirilebilir.

FSL yapıları değişiklik hücre ve virion yüzeylerin yanı sıra aynı zamanda dolaşımdaki hücrelerin in ^vivo Modifikasyon 7 neden laboratuvar hayvanları dolaşıma doğrudan infüze edilebilir ve ^virüsler 12, ^toksinler, 12 ve ^antikorlar 7 inhibe . FLS yapıları da süslemek için lipozomlar kullanılır ve onlar hareketsiz kağıt yüzeyler ^13, üzerine basılabilir ve daha sonra tanı testleri kullanılabilir .

FSL yapıları giderek artan sayıda canlı hücreleri kolayca değiştirmek için yetenek, hücre yüzeyinde biyoloji çalışma için yararlı bir araştırma ve geliştirme aracı olarak kanıtlamak gerekir.

Malzemeler